UPLC同时测定白及药材中9种指标成分的含量

　　[摘要] 采用超高液相色谱（UPLC）的方法，以Acquity BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm） ，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，流速为0.3 mL·min^-1，柱温45 ℃，检测波长280 nm的色谱条件同时测定白及药材中的4-羟基苯基-葡萄糖苷、4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-葡萄糖苷、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯、二氢菲5和1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-[4-O-肉桂酰基]葡萄糖苷、 二氢菲1、苄基氢菲3和1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-[4-O-肉桂酰基-6-O-乙酰基]葡萄糖苷9个指标成分。各指标成分之间分离度良好，在选定的浓度范围内线性关系良好（r≥0.999 3），平均加样回收率（n=6） 为98.15%～102.2%，RSD为2.1%～3.6%，表明所建立的方法重复性、耐用性良好，结果准确，经对野生和人工种植白及药材分析，野生白及所测定的9种成分含量高于人工栽培白及药材，为白及药材的质量评价和控制提供科学依据。
　　[关键词] 白及；多指标成分；超高液相色谱（UPLC）
　　[收稿日期] 2014-01-02
　　[基金项目] 国家自然科学基金项目（81360636）；贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目（黔科合中药字[2010]5027号）；贵阳市科学技术计划项目（筑科合同[2012204]20号）
　　[通信作者] 李勇军，教授，主要研究方向天然药物化学和中药新药研发，Tel：（0851）6908468，E-mail：gywam100@163.com
　　白及为兰科植物白及Bletilla striata （Thund.） Reichb. f.的干燥块茎，具有收敛止血，消肿生肌等功效[1]。现代药理研究表明，白及药用功能广泛，药用价值高，具有止血，抗菌，抗肿瘤及促进血管内皮细胞生长等药理作用。另有研究发现白及正逐渐成为我国现代医药工业的重要原材料[2]。但目前白及药材质量控制标准较薄弱，《中国药典》2010年版一部和第二增补版仅收载了性状、薄层色谱鉴别等[3]，无含量测定等重要的质量控制指标，因此难以评价和控制白及的质量。作者在对白及的研究中，曾对白及的多糖和其中含量较高的化合物militarine{双[4-（β-D-吡喃葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯}为指标进行了质量控制研究[4-6]，而白及化学成分有芪类、联苄类、菲类、联菲类、联菲醚类、菲并吡喃类、联苄葡萄糖苷类、菲并螺甾内酯类以及甾体、三萜和花色素苷类等化合物近50种[7-9]，以白及中单一指标含量控制白及药材质量的方法，不能较全面的反映白及整体质量信息。文献报道白及水提物及甲醇提取物是白及止血及抗溃疡的有效部位[9]，国内外对白及的质量控制方法研究主要为多糖、总酚大类成分、单一成分（militarine， 肉桂酸）或某一类成分的分析报道[4-5，10-12]，未见同时测定白及药材中4-（葡萄糖氧）苄醇及肉桂酸酯、2-异丁基苹果酸酯、二氢菲和苄基氢菲类的多指标成分的报道。本研究以白及中分离到的含量较高化合物，应用超高液相色谱法，建立了同时测定白及中9个指标性成分的分析方法，为白及药材的质量控制和评价提供科学依据。
　　1 材料
　　Acquity UPLC（美国沃特世公司，包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、色谱柱温箱、阵列二极管检测器、Empower 2工作站）；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；1/10万电子天平（AE240，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）。
　　白及药材由贵阳医学院药学院生药学与药用植物学教研室龙庆德副教授鉴定为兰科植物白及B. striata的干燥块茎。4-羟基苯基-葡萄糖苷（4-hydroxymethylphenyl β-D-glucoside）；4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯（blestroside）；1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-葡萄糖苷（dactylorhin A）；1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militarine）；二氢菲5（dihydrophenanthrene 5）；1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-[4-O-肉桂酰基]葡萄糖苷（gymnoside V）；二氢菲1（dihydrophenanthrene 1）；苄基氢菲3（benzylphenanthrene 3）和1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-[4-O-肉桂酰基-6-O-乙酰基]葡萄糖苷（gymnoside Ⅸ）由本实验室从白及药材中分离得到，经¹H，¹³ C-NMR，MS，UV和 IR鉴定，TLC纯度检查显示单一斑点，UPLC-PDA在多个波长检测，峰面积归一化含量均大于98%；乙腈（色谱纯，美国TEDIA有限公司，批号AS1122-001），甲酸（美国TEDIA有限公司，批号FS0630-020），甲醇（分析，上海振兴化工一厂，批号200909061），纯净水（广州屈臣氏食品饮料有限公司，批号20120722）。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件
　　ACQUITY BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm× 150 mm， 1.7 μm）；流动相乙腈（A）-水（B）；流速0.3 mL·min^-1；梯度洗脱（0～10 min，5%～16% A；10～24 min，16%～30% A；24～27 min，30%A；27～32 min，31% A；32～33 min，31%～37% A；33～45 min，37%～55% A；45～46 min，55%～100% A）；柱温为45 ℃，阵列二极管检测器（PDA），检测波长280 nm，进样量2 μL。

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