四川道地产区乌头药材不同部位6种生物碱含量对比研究

　　摘要 目的：研究四川道地产区6种乌头生物碱在不同部位的分布差异，比较母根、子根基于化学成分的区别。方法：采用超高效液相色谱法（UPLC）测定19批四川道地乌头药材母根、子根、须根中6种乌头生物碱含量，并结合SPSS统计软件对数据进行显著性差异、聚类分析和主成分分析研究。结果：6种乌头生物碱在3个部位的分布差异各不相同。母根、子根中苯甲酰新乌头碱、新乌头碱含量有显著性差异，为两者的差异性指标成分。聚类分析、主成分分析也将供试样品分成母根、子根两大类。结论：母根、子根的物质基础有差别，可为临床正确使用提供参考。
　　关键词 UPLC；乌头；母根；子根；乌头生物碱；区别
　　收稿日期 2013-03-15
　　[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2013zx09402202）
　　通信作者 *冯锋，教授，E-mail：fengsunlight@163.com
　　作者简介 钱长敏，硕士研究生，主要从事药材资源的研究，Tel：15902245166，E-mail：qianchangmin@126.com 毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.为一常用毒性药用植物。药典收录的相关药材有川乌和附子。两者分别为乌头的母根和子根[1]。虽然药典已明确了药用部位，但川乌和附子的混用还是较多。课题组在终端药材市场采购时发现川乌除有母根之外，许多为小子根，附子的生药材多为大个子根，这与之前文献报道一致[2]。近年来，已有针对乌头不同组织的多项研究，包括毒性、化学成分的比较等[3-7]。其中乌头生物碱研究较多，主要比较了总生物碱和3种双酯型生物碱的差别，但未见有单酯型生物碱的含量差异研究。四川江油为乌头药材的道地产区，有着悠久的种植历史，其年产量占了全国乌头药材很大的比重。本文建立了超高效液相色谱法（UPLC）测定江油多批次乌头样本母根、子根、须根中6种乌头生物碱含量，比较研究江油6种乌头生物碱在不同根部的分布差异，同时结合聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA），系统探讨母根与子根基于6种乌头生物碱的区别，以期通过多样本量多化学成分来评价四川道地产区药材质量和根部组织的差异，为已有化学成分研究提供补充，为母根、子根在临床的正确合理使用提供更多的参考依据。
　　1 材料
　　1.1 仪器
　　超高效液相色谱系统（ ACQUITY UPLC，美国Waters公司，包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、TUV检测器、Empower2工作站），电子天平（XS205，瑞士METTLER TOLEDO公司），粉碎机（MF10，德国IKA公司），高速冷冻离心机（ST16R，美国Thermo公司），平行溶剂蒸发仪（Q-101，瑞士BUICH公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。
　　1.2 药品与试剂
　　苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱（纯度和批号分别为99.6%，111795-200901；96.5%，111794-201102；99.5%，111796-200901；100%，110799-200505；100%，110720-200410；99.5%，110798-200805；均购于中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；醋酸铵（优级纯，天津市光复科技发展有限公司）；碳酸氢铵（优级纯，天津市元力化工有限公司）；醋酸（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；异丙醇、醋酸乙酯（分析纯，天津市化学试剂二厂）；氨水（分析纯，天津市化学试剂三厂）；超纯水（Milli-Q制备）。
　　1.3 药材样本采收
　　乌头药材样本于2012年6月底（产区采收季）实地采自道地产区四川江油，在当地不同种植区域共收集19批样本，主要为根部及与根部相连少部分茎叶。除去泥沙，晒干，将根部分为母根、子根、须根，备用。19批药材样本经天津大学药物科学与技术学院高文远教授鉴定，均为毛茛科植物乌头A. carmichaelii，样品标本保存于天津天士力集团研究院现代中药研究所，样本信息见表1。
　　表1 19批乌头药材样本信息
　　Table 1 The sources of 19 batches of Aconitum carmichaelii
　　注：每个样本均含有母根、子根、须根。
　　2 方法
　　2.1 对照品溶液的制备
　　取苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱对照品适量，精密称定，加0.1% 醋酸甲醇至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为372.8，61.2，130，602.4，70.4，1 102.4 mg·L^-1的混合对照品储备液，存储于4 ℃冰箱中备用。
　　2.2 供试品溶液的制备
　　分别取各样品粉末（过3号筛）2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇-醋酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz，水温在25 ℃以下）30 min，放冷，再称重，用异丙醇-醋酸乙酯（1∶1）混合溶液补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.1% 醋酸甲醇溶液3 mL溶解，转移至离心管中，于12 000 r·min^-1下高速离心10 min，取上清液，即得。
　　2.3 超高效液相色谱条件
　　ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相A 30 mmol·L^-1 NH₄AC水溶液（氨水调pH 10.0），流动相B 乙腈；洗脱梯度：0～1.5 min，28%乙腈，1.5～2.8 min，28%～38%乙腈，2.8～5.5 min，38%乙腈，5.5～7.0 min，38%～60%乙腈，7.0～10 min，60%～28%乙腈；检测波长235 nm；柱温40 ℃；进样量2 μL；对照品及样本（包括母根、子根、须根）的UPLC图见图1。

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