不同种源地广金钱草药材质量变异与遗传多样性分析

　　[摘要] 目的：研究不同种源地广金钱草药材质量变异及遗传多样性，为合理利用广金钱草种质资源及优良品种选育奠定基础。方法： 采用AFLP分子标记技术，对18个种源地广金钱草进行遗传多样性分析，用NTSYSpc2.11F软件计算并分析广金钱草种质间的相似度，构建遗传系统进化树；采用HPLC测定药材夏佛塔苷含量，并进行方差分析。结果：通过筛选得到8对AFLP引物组合，共扩增出844个DNA条带，多态性条带为717个，多态性位点平均为84.27%；通过聚类分析，将18个种源地的广金钱草种质分为3大类。种源间广金钱草药材夏佛塔苷含量差异显著，海南三亚种源夏佛塔苷含量显著高于其他种源地药材夏佛塔苷含量。结论：不同种源广金钱草药材质量差异显著，遗传多样性丰富，蕴藏着优质的种质资源，可以进行综合开发及优良品种选育。
　　[关键词] 广金钱草；质量变异；遗传多样性
　　[稿件编号] 20120917016
　　[基金项目] 国家科技基础性工作专项重点项目（2007FY110600）；中山市科技局华南现代中医药城项目（20101H020）
　　[通信作者] *杨全，Tel： （020）39352327，Email： yangquan7208@vip.163.com
　　广金钱草为豆科植物广金钱草Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的干燥地上部分。具有利湿退黄，利尿通淋的功效[1]，广金钱草主要含有黄酮、生物碱、酚类、挥发油等化学成分，现代药理研究表明本品具有抗泌尿系统结石、改善心血管系统、抗炎和利胆的作用。也是中成药“消石饮”、“消炎利胆片”、“消石片”和“金钱草冲剂”中成药的主要原料之一[2]。近年来，不少专家学者对广金钱草的研究主要集中在栽培技术[3]、药理[4]、化学成分[5]等方面，有关广金钱草遗传多样性和不同种源地有效成分含量差异方面未见报道，课题组在进行广金钱草资源调查的过程中，采集了不同种源地PCR样品和有效成分分析样品，从有效成分含量差异和遗传学的角度探讨药材质量变异和遗传变异。
　　扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism， AFLP）是一种有效的物种遗传多样性分析的分子标记方法[6]。由于其具有快速、灵敏、稳定、所需DNA 量少、多态性丰富和重复性好等特点，已广泛应用于人参[7]、黄芩[8]、天麻[9]、夏枯草[10]等植物的遗传多样性研究。本文采用AFLP技术，研究不同种源地的广金钱草在分子水平上的遗传变异，采用HPLC分析广金钱草质量变异情况，为今后开展种源选择、种质鉴定、优良品种选育奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 广金钱草
　　广金钱草为2008年7—8月分别在广东、广西、海南采集的野生样品，每个种源取3株广金钱草成熟、无病虫害的健康叶片，混合后作为1个样品，将新鲜叶片置装有变色硅胶的封口袋内，迅速干燥，备用；每个种源地采集3份广金钱草，干燥后作为有效成分分析样品备用。种源地及样品编号见表1。
　　1.2 仪器与试剂
　　高效液相色谱仪（Waters 2695型，USA），二极管阵列检测器（Waters 2996型，USA），数控超声波清洗器（KQ500DE型，中国昆山），色谱柱（C18，4.6 mm×250 mm，5 μm， phenomenexLuna），PCR扩增仪（9600型，Perkin Elmer， USA），低温冷冻离心机（3K18型，Sigma ，USA），测序仪 （377型，USA ），核酸蛋白检测仪（Biorad，USA），电泳仪（DG3D型，北京鼎国）。
　　内切酶、引物、T4 连接酶（北京鼎国），丙稀酰胺、尿素、甲酰胺、甲叉丙稀双酰胺（Sigma）。
　　表1 野生广金钱草种质资源信息
　　Table 1 Samples of the wild Desmodium styracifolium germplasm resources
　　1.3 夏佛塔苷含量测定
　　参照《中国药典》[1]（2010年版一部）广金钱草项下的含量测定方法。流动相甲醇水（32∶68）；流速0.8 mL·min-1；柱温 35 ℃；检测波长 272 nm；进样量 10 μL。回归方程为Y=19 324X-1.315 1，r=1.000 0（n=6）；线性范围0.219～7.841 μg ，r=1.000 0（n=6）。精密度RSD 0.15%（n=6）；重复性RSD 3.7%（n=6）；样品24 h内稳定，RSD 0.2%（n=6）；加样回收率RSD 1.7%。以夏佛塔苷作为对照品，绘制标准曲线，计算百分含量。
　　1.4 AFLP分析
　　1.4.1 总DNA提取 采用CTAB法[11]进行基因组总DNA的提取，用UItrospc 2000 紫外可见分光光度计检测DNA的纯度及浓度。
　　1.4.2 接头和引物 从64对AFLP引物中筛选出8对带型分布均匀、多态性高且分辨力强的引物进行AFLP分析，见表2。
　　1.4.3 酶切与连接 本实验参照鼎国生物技术公司AFLP试剂盒说明书进行。首先采用NEB （New England BioLabs）公司提供的2种限制性内切酶Pst I和Mse I对基因组总DNA进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶，将Pst I和Mse I接头与酶切片断连接起来，酶切连接一步完成，酶切连接体系20 μL：总DNA 4 μL（50 mg·L-1）；Adapter 1 μL；Pst I/Mse I 2 μL；10×Reaction buffer 2.5 μL；10 mmol·L-1 ATP 2.5 μL；T4 Ligase 1 μL；ddH2O 7 μL。混匀离心数秒，37 ℃保温5 h，8 ℃保温4 h，4 ℃过夜。

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