实验室菌株管理制度

　实验室菌株管理制度

　1. 目的

　建立实验室菌株管理制度。

　2. 范围

　适用于实验室菌株的管理。

　3. 职责

　3.1.实验员和实验室管理员负责对本制度实施。

　3.2.QA 负责监测本规程的执行。

　4. 规程

　4.1. 菌种管理

　4.1.1.涉及菌种 ① 大肠埃希菌 Escherichia coli ② 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ③ 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa ④ 乙型副伤寒沙门菌 Salmonella apecies ⑤ 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis ⑥ 生孢梭菌 Clostridium sporogenes ⑦ 白色念珠菌 Candida albicans ⑧ 黑曲霉 Aspergillus niger 4.1.2.菌种采购 根据计划及定期检查的结果，按时从省级药检所、卫生防疫站等部门采购来自中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical Culture Collection，CMCC）等国际法定菌种保藏机构的标准菌株。菌种到达实验室后，接受菌种时应仔细检查菌种的名称、数量、完整性等，并做好记录工作，如名称、菌号、数量、来源、接种日期、代数等（见附件一：菌种采购登记表）。

　4.1.3.菌种复活 4.1.3.1.冻干菌种

　若购入的标准菌株是玻璃安瓿瓶装的冻干粉剂则需对冻干菌种进行复活。首先清洁安瓿，安瓿的表面用 75%的酒精擦拭并让其自然干燥；然后用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）；再用一无菌吸管移取 1-2ml适宜的胰酪大豆胨液体培养基到安瓿中；轻轻地旋转安瓿使冻干菌种和胰酪大豆胨液体培养基充分混合并完全溶解；最后将安瓿内菌液转接到相应的液体培养基或固体培养基中在适宜的条件下培养，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌于 30-35℃培养 18-24 小时，白色念珠菌于 20-25℃培养 24-48 小时，黑曲霉于 20-25℃培养 5-7 天。

　4.1.3.2.斜面菌种

　若购入的标准菌株是试管装琼脂斜面则不需要进行菌种复活。

　4.1.4.菌种确认 取上述冻干菌种（细菌）的液体培养基中的培养物或斜面菌种（细菌）的斜面培养物划线接种到胰酪大豆胨琼脂平皿上，30-35℃培养 48 小时，培养结束后观察菌落形态，然后挑取单一的纯菌落，进行革兰氏染色和镜检，观察其染色特性及菌形。

　取上述冻干菌种（真菌）的液体培养基中的培养物或斜面菌种（真菌）的斜面培养物划线接种到沙氏葡萄糖琼脂平皿上，20-25℃培养 5-7 天，观察菌落形态，然后挑取单一的纯菌落，进行染色和镜检，观察其染色特性及菌形。

　4.1.4.1.菌落形态

　A. 大肠埃希菌：胰酪大豆胨琼脂平皿或斜面上，乳白色，光滑，薄，蔓延，半透明。

　B. 金黄色葡萄球菌：胰酪大豆胨琼脂平皿或斜面上，白色至浅黄色，光滑，湿润，全缘。

　C. 铜绿假单胞菌：胰酪大豆胨琼脂平皿或斜面上，白色，伸展形，边缘透明，不规则，培养基变为浅绿色至暗黑色。

　D. 沙门菌：胰酪大豆胨琼脂平皿或斜面上，浅灰色，湿润，光滑，半透明。

　E. 枯草芽孢杆菌：胰酪大豆胨琼脂平皿或斜面上，奶油色至微褐色，粗糙，不透明，不闪光，蜡质，蔓延。

　F. 生孢梭菌：胰酪大豆胨琼脂平皿或斜面上，中部突起，白色至淡黄色，边缘模糊不规则，表面无光泽。

　G. 白色念珠菌：沙氏葡萄糖琼脂平皿或斜面上，乳白色，湿润，光滑，易挑取，正、反面及边缘、中心颜色一致，质地均匀。

　H. 黑曲霉：沙氏葡萄糖琼脂平皿或斜面上，起初白色，常常出现鲜黄色区域，后黑色，反面无色或中央部分略带黄褐色。

　4.1.4.2.镜检

　A. 大肠埃希菌：革兰氏阴性杆菌或短杆菌，无芽孢。

　B. 金黄色葡萄球菌：革兰氏阳性球菌，排列不规则，堆聚似葡萄串状。

　C. 铜绿假单胞菌：革兰氏阴性杆菌，长短不一，无芽孢。

　D. 沙门菌：革兰氏阴性杆菌，无芽孢。

　E. 枯草芽孢杆菌：阳性杆菌，部分内含芽孢，椭圆形，中生或次端生。

　F. 生孢梭菌：革兰氏染色阳性，芽孢卵圆形、次端生。

　G. 白色念珠菌：卵圆形，出芽繁殖，革兰氏阳性。

　H. 黑曲霉：菌丝为有隔的多细胞，分生孢子梗顶端膨大成顶囊，顶囊的表面以辐射状长出二层小梗，小梗顶端产生一串圆形的分生孢子。

　4.1.5.菌种传代与保藏 4.1.5.1.将微生物接种至一新的培养基上/内，每萌发一次即称为一代，菌种的传代次数（自原始冻干菌种起）不得超过 5 代。

　4.1.5.2.本实验室菌种保藏采用斜面低温保藏法。将菌种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移到 2-8℃冰箱中保藏。视菌种的生长情况，正常情况下芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌）每 3 个月传代接种一次，其他细菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、生孢梭菌）每月传代接种一次，酵母菌（白色念珠菌）每 4 个月传代接种一次，丝状真菌（黑曲霉）每 4 个月传代接种一次。每次传代接种 2 支或 2 支以上试管，一支作为下一次传代使用，其他的作为日常检验中使用。

　4.1.5.3.菌种传代操作步骤

　细菌和酵母菌：右手执接种工具，左手执试管，烧针灭菌，拔塞烧口，挑菌移植，烧口塞管，烧针灭菌，培养。

　霉菌：将 2-3ml 0.9%无菌氯化钠溶液加入到原菌种管内，反复震摇，将孢子洗脱，取适量孢子悬液接种于琼脂斜面上，烧口塞管，培养。

　4.1.5.4.培养基及培养条件

　大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌使用胰酪大豆胨琼脂培养基，培养条件为 30-35℃培养 24 小时(枯草芽孢杆菌培养 48 小时)，白色念珠菌和黑曲霉使用沙氏葡萄糖琼脂培养基，20-25℃培养 5-7 天。

　4.1.5.5.质量控制

　每次传代接种以后观察菌落形态和染色镜检，若发现有其他菌落生长，则应作进一步调查，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于实验中。将符合规定的菌种进行编号、贴上标签(见附件二、菌株保存标签)，标签中应表明名称、菌号、编号、有效期、接种人等。菌种的编号按接种日期、代数和数量编写。如 2018 年 1 月 1 日传代接种大肠埃希菌 2 支，用来传代的大肠埃希菌是第 3 代，那传代以后的菌种编号为 20180101-3-1，20180101-3-2，前面的 20180101 是接种日期，中间的 3 表示代数，最后的 1 和 2 表示数量。菌种传代的整个过程都必须做好详细的菌种传代记录（见附件三：菌种传代、确认、处理记录）。

　4.1.6. 菌种储存

　菌种需单独放置于 2-8℃冰箱内保藏，有专人负责保管并建立实验室现有菌种清单（见附件四：实验室现有菌种清单）。

　4.2. 菌种的使用

　4.2.1.菌种必须在有效期内才能使用，每次使用应做好相应的记录工作（具体见附录五：菌种使用记录）

　4.2.2.菌悬液的制备 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌和枯草芽孢杆菌接种于胰酪大豆胨液体培养基中，生孢梭菌接种于硫乙醇酸盐流体培养基，30-35℃培养 18-24 小时；白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖液体培养基中，20-25℃培养 24-48 小时；黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，20-25℃培养 5-7 天。用 0.9%无菌氯化钠溶液（稀释黑曲霉孢子时加入 0.05%聚山梨醇酯-80）制成实验中规定浓度的菌悬液或孢子悬液。稀释后菌悬液于 2-8℃条件下保存，制备后的 24 小时内使用。

　4.3. 菌种的销毁

　使用后的菌种，必须经过 121℃、30 分钟高温高压湿热灭菌处理，方可遗弃，同时做好销毁记录。

　4.4. 其他相关事项

　菌种是特殊的标准品，在一定条件下，许多都是病原菌，如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、白色念珠菌等。所以必须实行严密安全的保藏管理，用于菌种保藏的冰箱需上锁；有关菌种的所有操作都应在生物安全柜中进行，仅有微生物实验员才能使用菌种；操作人员必须穿工作服，配戴手套，口罩等防护用品；在操作过程中，要求无菌操作，防止交叉污染或将污染传播到别的地方。

　5. 记录

　菌种采购登记表 菌种保存标签 菌种传代、确认、处理记录 实验室现有菌种清单 菌种使用记录 生物指示剂购买和领用记录 6. 相关文件

　实验室管理规程

　HYT/SMP-QA-ZB-004 偏差调查与处理管理规程

　HYT/SMP-QA-ZB-008 检验异常管理规程

　HYT/SMP-QA-ZB-010 7. 参考文献

　无菌医疗器具生产管理规范

　YY0033-2000

　中国药典 2020 版

　8. 修订历史

　序号 生效日期 文件编号及版本号 修订性质及原因 修订内容及具体条款

　附件 1：

　菌种采购清单

　编号：

　HYT/SMP-QA-ZB-028 日 期 名 称 菌 号 代数 批号 来 源 数 量 经办人 复核人

　附件 2：

　 菌种保存标签

　 HYT/SMP-QA-ZB-028 菌种名称

　标 准 号

　菌种编号

　接种日期

　传 代 数

　有 效 期

　传 代 人

　 附件 3：

　菌种传代、确认、处理记录 编号：

　 HYT/SMP-QA-ZB-028

　菌种名称 菌

　号 来

　源 代

　数

　 菌种传代接种情况：

　菌种

　确认 菌落形态：

　 镜检：

　 API 鉴定：

　确认结果

　□符合规定

　□不符合规定 操作人：

　复核人：

　菌种编号

　保藏条件

　有效期

　处理情况 菌种编号 灭菌温度 灭菌时间 操作人 日期

　 附件 4：

　实验室现有菌种清单 编号：

　 HYT/SMP-QA-ZB-028

　菌种名称

　状

　态

　菌

　号

　大肠埃希菌 Escherichia coli

　 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus

　 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa

　 沙门菌 Salmonella apecies

　 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis

　 生孢梭菌 Clostridium sporogenes

　 白色念珠菌 Candida albicans

　 黑曲霉 Aspergillus niger

　“○”表示无，“●”表示有

　 QC/日期：

　部门经理/日期：

　 附件 5：

　菌种使用记录 编号：

　 HYT/SMP-QA-ZB-028

　菌种名称及菌号

　菌种编号

　有效期

　日

　期 编

　号 使用人 日

　期 编

　号 使用人

　 附件 6：

　 生物指示剂购买和领用记录

　编号：

　HYT/SMP-QA-ZB-028

　指示剂名称：

　购买日期：

　批号：

　数量：

　保存条件：

　有效期：

　备注：

　日期 数量 结余 领用人 发放人 日期 数量 结余 领用人 发放人

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