检验科PCR实验室作业指导

发布时间:2020-11-16 来源: 思想汇报点击：

　实验室作业指导书文件编号：SWAQ-PCR-3-2018

　第第 A 版

　编制：

　沈龙华

　审核：

　鲁君艳

　批准：

　姜志刚

　生效日期：2018 年年 05 月月 05 日永州市中心医院南院检验科

　永州市中心医院南院检验科 R PCR 实验室

　作业指导书

　文件编号：AQSC-PCR-3-2018

　版本/修订号：A/0 主题内容目录生效日期：20180505

　第 2 页，共 37 页

　目

　录章节名

　称页码 01 目录 2 02 修订页 3 03 实验室工作流程标准操作程序 4 04 标本接收/拒收标准操作程序 5 05 实验室标本处理标准操作程序 6 06 实验耗材消毒标准操作程序 7 07 实验室清洁消毒标准操作程序 8 08 PCR 扩增仪标准操作程序 9 09 生物安全柜标准操作程序 12 10 乙型肝炎病毒核酸定量检测标准操作程序 14 11 肠道病毒 71 型核酸检测标准操作程序 18 12 丙型肝炎病毒 RNA 检测标准操作程序 22 13 高危型人乳头瘤病毒 DNA 检测标准操作程序

　26 14 肺炎支原体 DNA 检测标准操作程序

　31 15 沙眼衣原体 DNA 检测标准操作程序

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　作业指导书

　文件编号：AQSC-PCR-3-2015

　版本/修订号：A/0 主题内容修订页生效日期：20151010

　第 3 页，共 37 页修订页

　序号修订内容批准人修订时间

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　作业指导书

　文件编号：JYKPCR01001 版本/修订号：A/0 主题内容工作流程标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 4 页共 37 页临床基因扩增实验室工作流程标准操作程序

　目的：规范临床扩增实验室日常工作流程，确保实验室各项操作的标准化，规范化范围：临床基因扩增实验室日常工作流程：

　一、标本处理流程 1.1、扫码接收：标本经标本接收室扫条码核收后进入临床基因扩增实验室 1.2、标本编号：对所有标本进行编号处理，并按次序做好标识；在 LIS 系统中对标本扫条码或手工编号建档，仔细核对每一标本及其相对应的化验申请单或标本条码标签上的信息：患者姓名、科别、床号，检验项目及标本质量 1.3、标本处理：

　1.3.1

　血液标本 3000 转/分离心 5 分钟，吸取上清液于 1.5ml 灭菌离心管内待检（如非当日检测标本则需放于-20℃冷冻冰箱保存）。

　1.3.2

　分泌物或咽拭子标本加 1ml 生理盐水后于振荡器上振荡混匀一分钟，吸取上清液于1.5ml 灭菌离心管内待检（如非当日检测标本则需放于-20℃冷冻冰箱保存）。

　1.3.3

　乳汁标本 3000 转/分离心 5 分钟，吸取上清液于 1.5ml 灭菌离心管内待检（如非当日检测标本则需放于-20℃冷冻冰箱保存）。

　1.4、将上述标本进行扩增实验前预处理后进行扩增实验。

　二、检测流程 2.1、实验室环境检查，做好相应的温度、湿度记录 2.2、仪器检查及维护并做好相应记录 2.3、准备实验所需的试剂、耗材 2.4、检测标本扩增前预处理 2.5、将预处理好的标本按要求放于扩增仪上，按相应程序进行基因扩增 2.6、扩增结束后，审核实验结果，发出实验报告 2.7、整理工作台面，做好检测后仪器维护保养工作三、结果报告流程

　分析核准检验结果：分析当日检测标准曲线，内标、阴阳性对照、质控及标准品等结果是否符合要求；反应曲线是否正常；检测结果是否异常需要复查。如无误则对当日各检验结果进行核准，发出检测报告。否则进行复查等处理四、检测结束工作流程 4.1 当日检验结束后关闭仪器及水源、电源，整理工作台面，对各项设备进行日维护保养 4.2 将已检验标本做好日期标记后放入已检测标本存储冰箱，放置一周后再交卫生员处理 SOP 文件的更改

　该标准操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人员提出并报请专业主管进行修改，科主任审核签字后生效。

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　文件编号：JYKPCR01002 版本/修订号：A/0 主题内容标本接收/ / 拒收标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 5 页共 37 页临床基因扩增实验室标本接收/ / 拒收标准操作程序

　一、目的：规范临床扩增实验室标本的接收与拒收工作，做好检测前质量控制。

　二、范围：临床基因扩增实验室

　三、标本接收程序内容

　标本经标本接收室扫条码核收送至实验室后，由实验人员验收。验收要求有：

　3.1 标本唯一性是否正确无误，即标本是否贴有条码及条码是否清晰或标本标签与申请单标

　签是否相符 3.2 申请检验项目与标本是否相符合 3.3 标本采集保存容器是否正确、容器有无破损 3.4 检查标本的外观是否异常（包括:有无溶血、有无乳糜状、抗凝血标本中有无凝块等及标

　本量是否足够）。

　3.5 检查标本采集时间与接收时间之间的时间间隔是否符合要求 3.6 如果标本不符合验收要求，则对标本进行拒收

　四、标本拒收程序内容

　如在标本验收中发现有以下不符合要求项时，则对此标本进行拒收，将其退回该标本的送检科室及送检者，要求重新采集标本送检 4.1 唯一性标志错误或条码、标签不清晰以及标签有脱落的标本 4.2 用错标本容器（如用错真空采血管等）或容器有破损的标本 4.3 溶血标本，乳糜血标本 4.4 抗凝血有凝块标本，未按要求抗凝标本 4.5 标本量不足的标本 4.6 未按标本保存要求进行送检前保存的标本 4.7 采集标本时间距送检时间过长而未达到要求的标本

　五、注意事项 5.1 标本接收验收与拒收工作实际上是实验室对送检验标本外在质量的把关，是做好检测前质量控制重要的一个环节。

　5.2 标本接收验收情况要做好记录，标本不合格的情况要及时反馈给申请科室。如有标本回退困难或标本重新采集困难的情况时，应与申请医生直接联系，告知标本不合格情况，如临床医生仍要求对此标本进行检测，应告知此不合格标本对检测结果造成的影响，并在检验报告做出相应的文字说明，并对以上情况做好记录。

　六、SOP 文件的更改该标准操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人员提出并报请专业主管进行修改，科主任审核签字后生效。

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　文件编号：JYKPCR01003 版本/修订号：A/0 主题内容标本处理标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 6 页共 37 页临床基因扩增实验室标本处理标准操作程序

　一、目的：扩增实验标本经验收合格后，需要经过一系列的处理，才能进行扩增实验检测。

　本程序规范临床扩增实验室标本扩增实验前的处理。

　二、范围：临床基因扩增实验室

　三、标本检测前处理规程内容 3.1

　DNA 扩增检测标本（HBV-DNA）：

　3.1.1 血液标本：标本经验收合格后，立即放入 37℃水浴箱温育 10 分钟，然后 3000 转/分钟离心 5 分钟，取血清 500ul，加入 1.5ml 灭菌离心管内，于－20℃±5℃保存（不超过 3个月，如超过 3 个月，需－70℃保存）； 3.1.2 乳汁标本：标本经验收合格后，立即 3000 转/分钟离心 5 分钟，取上清 500ul，加入 1.5ml 灭菌离心管内，于－20℃±5℃保存（不超过 3 个月，如超过 3 个月，需－70℃保存）

　3.2

　RNA 扩增检测标本：

　3.2.1 HCV-RNA 检测标本：标本经验收合格后，立即放入 37℃水浴箱温育 10 分钟，然后 3000 转/分钟离心 5 分钟，取血清 500ul，加入 1.5ml 灭菌离心管内，于－20℃±5℃保存（不超过 3 个月，如超过 3 个月，需－70℃保存）； 3.2.2

　EV-71 RNA 检测标本：本检测标本类型为咽拭子。咽拭子标本经扫码核收后，加入 1ml 生理盐水，充分振荡（振荡仪振荡 1 分钟），取 500ul 溶液标本，加入 1.5ml 灭菌离心管内，于－20℃±5℃保存（不超过 3 个月，如超过 3 个月，需－70℃保存）

　3.3 上述离心标本如在 2 小时内检测，则不需冷冻保存；冷冻标本检测前需解冻复溶，可于 37℃水浴箱温育 5 分钟复溶，避免反复冻溶。

　四、SOP 文件的更改该标准操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人员提出并报请专业主管进行修改，科主任审核签字后生效。

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　文件编号：JYKPCR01004 版本/修订号：A/0 主题内容耗材消毒标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 7 页共 37 页临床基因扩增实验室实验耗材消毒标准操作程序

　一、目的：规范临床扩增实验室扩增实验耗材消毒工作。

　二、范围：临床基因扩增实验室

　三、实验耗材消毒内容 3.1 消毒耗材详单：1.5ml 离心管、吸嘴（10ul、200ul、1000ul）、扩增反应管（带盖）

　3.2 消毒前准备：

　3.2.1 将离心管、反应管分别装于消毒盒内

　3.2.2 将吸嘴按 10ul、200ul、1000ul 分别装于吸嘴盒内 3.3 消毒：高压灭菌锅 121℃，30 分钟高压灭菌 3.3.1 确保高压灭菌锅状态正常，加水，确认水位在水位刻度以上 3.3.2 将分装好耗材的各消毒盒放于高压灭菌锅内，依次摆好 3.3.3 插上电源插头，打开放气阀和安全阀阀门，待高压灭菌锅上气后排气 5 分钟 3.3.4 关闭放气阀和安全阀阀门，待气压指示针达到刻度 115 时开始计时 3.3.5 当气压指示针达到 121 时，拔下电源插头；当气压指示针即将达到刻度 115 时插上

　电源插头；如此循环 30 分钟。

　3.4 消毒后处理：将高压灭菌后的消毒盒、吸嘴盒放于烤箱内烤干备用 3.5 备注：高压灭菌锅在微生物实验室。

　四、SOP 文件的更改该标准操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人员提出并报请专业主管进行修改，科主任审核签字后生效。

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　文件编号：JYKPCR01004 版本/修订号：A/0 主题内容清洁消毒准操作程序

　生效日期：20151010

　第 8 页共 37 页临床基因扩增实验室清洁消毒标准操作程序

　一、目的：规范临床扩增实验室清洁消毒工作。

　二、范围：临床基因扩增实验室

　三、清洁消毒内容 3.1 扩增实验开始前，整理实验室工作台面，搞好实验室卫生 3.2 对生物安全柜进行紫外灯消毒一小时，同时用紫外灯对扩增区进行消毒一小时 3.3 扩增实验过程中按要求进行操作，防止污染发生 3.4 生物安全柜内操作结束后，立即进行紫外灯消毒一小时 3.5 扩增实验结束后，整理工作台面，搞好实验卫生 3.5.1

　做好生物安全柜的清洁工作：用 75%酒精（严禁用次氯酸钠）对生物安全柜各表面进行擦洗 3.5.2

　次氯酸钠溶液擦工作台面 3.5.3

　清洁扩增仪表面 3.6

　对实验室进行紫外灯消毒一小时 3.7

　开窗，做好实验室通风

　四、SOP 文件的更改该标准操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人员提出并报请专业主管进行修改，科主任审核签字后生效。

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　文件编号：JYKPCR02001 版本/修订号：A/0 主题内容 N SLAN 扩增仪标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 9 页共 37 页 SLAN＠荧光定量 R PCR 扩增仪标准操作程序

　一、目的：规范 SLAN＠荧光定量 PCR 扩增仪的标准操作。

　二、范围：临床基因扩增实验室三、责任人要求：经过培训考核合格的临床扩增实验室工作人员四、仪器厂家：上海宏石医疗科技有限公司五、检测原理：

　SLAN ® 荧光定量 PCR 扩增仪集 PCR 扩增（重复循环 PCR 三个基本反应步骤：变性-退火-延伸三过程，1～2 小时将待测目标基因扩增放大）、荧光检测（在 PCR 反应系统中加入一个荧光标记探针，激发的荧光信号值与所扩增的目标基因数量成正比，通过对试管内荧光值的实时监测，来实现模板的定量检测）于一身，实时监测每个试管内荧光量的增长过程，在扩增结束后，系统通过软件对实验数据自动进行分析，绘制标准曲线，显示每个标本的起始浓度等实验结果。

　六、标准操作：

　6.1 开机前检查：整理扩增仪台面，保持实验室环境稳定、仪器表面清洁，电源稳定 6.2 开机自检：打开电源开关及 LIS 电脑，等待仪器自检，自检完成后，打开工作软件。

　6.3 实验样品上机：点击“热盖”选项，等待扩增仪自动热盖完成后，推开位于仪器上方的盖子，即将盖子按其轨道往后推。将实验样品按次序放入加热模块，关闭仪器盖子。

　6.4 扩增检测设置：

　6.4.1 文件设置：打开工作软件，点击左上方的“新建文件”按钮，选择新建一个 PCR 文

　件，点击“确定”键，在弹出的对话框中选择通道，点击“确定”。

　6.4.2 板面设置：点击“模板编辑”后，选中所放样品位置对应的孔，鼠标点击右键，

　进行样品类型的选择：

　6.4.2.1 已知标准品设为标准品，点击“检验项目”，在下拉菜单中选择 HBV，在属性一

　栏输入具体的浓度值，点击“确定”保存；

　6.4.2.2 待测样本设为样品，点击“检验项目”，在下拉菜单中选择 HBV，点击“确定”

　保存； 6.4.2.3 阳性对照，阴性对照及质控品分别选择相应的选项，点击“确定”保存 6.4.3 扩增程序选择：点击“基因扩增”，进入基因扩增版面，点击屏幕右方的“打开”

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　文件编号：JYKPCR02001 版本/修订号：A/0 主题内容 N SLAN 扩增仪标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 10 页共 37 页

　按钮，选择已经设置好的程序名称，打开即可。

　6.5 运行：设置完成后，点击“开始实验”按钮，仪器会提示是否要开始，点击“确定”。

　6.5 数据分析：

　程序运行结束（仪器提示：“正常运行结束”）后，所有的数据仪器会自动给出。

　点击“实验结果”按钮，进入分析界面，即可显示所有反应管的样品名及浓度值。结合实验结果版面下的“模板模式”、“扩增曲线”、“标准曲线”、“报告模式”下数据，综合分析实验结果，发出实验报告 6.6 关机实验运行及分析完成后，点击“工具”按钮，在下拉菜单中点击“打开热盖”，待仪器打开后，即可向后推开盖子，取出已扩增反应管。关闭扩增仪及 LIS 电脑，整理清洁扩增仪台面。

　七、仪器保养与维护

　7.1 仪器清洁：每周一检测结束后，关闭扩增仪并拔掉电源线，用软布沾清水擦洗（擦洗后一定要将仪器擦干），注意一定不能用化学剂用有机溶液清洗。用湿棉纤将缝隙中的灰尘清除。

　7.2 反应孔清洁：反应孔沾染灰尘或杂质后，会影响 PCR 扩增和荧光检测。每三个月清洁一次反应孔，即用吹气球轻轻吹拭反应孔。仪器不使用时必须关闭上盖，并套上防尘罩。

　7.3 仪器保护：

　7.3.1 不能频繁开关扩增仪，两次开关间隔时间必须超过 1 分钟； 7.3.2 一次实验结束后，模块往往还有较高温度，不能立即关闭扩增仪电源，应让风扇继续运行三十分钟后，当模块温度下降至室温时再关闭扩增仪电源开关或进行下一次实验。

　7.3.3 扩增仪的控温范围为 4-99℃，禁止在扩增仪上进行沸水浴和低温保温操作。

　7.3.4 实验室工作人员禁拆卸扩增仪。如有需要，请联系厂家工程师进行拆卸操作。

　7.3.5 更换保险丝：扩增仪装有两个 5.0A 保险丝。当保险丝损坏后，工作人员应知晓保险丝的更换：切断主机电源并拔掉电源线，用一字螺丝刀逆时针拧开机厢后方保险丝盒盖，更换保险丝（保险丝型号：Φ5×20mm-5A、250V），再盖好保险丝盒盖，最后插上电源线。

　八、附录：

　8.1 仪器组成部分：

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　作业指导书

　文件编号：JYKPCR02001 版本/修订号：A/0 主题内容 N SLAN 扩增仪标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 11 页共 37 页

　计算机系统、控制部件、热盖部件、热循环部件、光电检测部件、传动部件、电源部件等。

　8.2 主要结构示意图：

　8.3 仪器面板标识：

　8.4 使用要求：

　电源 220V（±10%）

　、50Hz

　操作环境温度 10 ～ 30 ℃

　功率 < 500VA

　操作环境相对湿度 20 ～ 80% 8.5 系统性能：

　样品容量 48 孔 × 0.2ml

　激发滤光片

　470nm、530nm、630nm（585nm）

　样品容积 20 ～ 50µl

　发射滤光片

　510nm、565nm、665nm（620nm）

　控温范围 4 ～ 99 ℃

　灵敏度

　最小分辨率为 1 个拷贝

　重复性 CV< 1.5%

　线性范围 10 0 ～ 10 10 个拷贝检测探针或染料

　FAM、SYBR、HEX、JOE、VIC、TET、ROX、TEXRD、CY5 8.5 联系方式：021-65107515 9 9 、P SOP 文件的更改

　该标准操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人员提出并报请专业主管进行修改，科主任审核签字后生效。

　前面板指示灯：

　后面板：

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　文件编号：JYKPCR02002 版本/修订号：A/0 主题内容生物安全柜标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 12 页共 37 页生物安全柜标准操作程序

　一、目的：规范生物安全柜的操作与维护保养工作，确保设备的正常运作，以保障操作人员的安全。

　二、范围：临床基因扩增实验室三、责任人要求：经过培训考核合格的临床扩增实验室工作人员四、仪器品牌型号：

　BIOBASE，BHC-1100IIA2（II 级 A2 型）

　五、仪器厂家：济南鑫贝西生物技术有限公司六、工作原理：

　生物安全柜的工作原理主要是将柜内空气向外抽吸，使柜内保持负压状态，安全柜内的气体不能外泄从而保护工作人员；外界空气经高效空气过滤器过滤后进入安全柜内，以避免处理样品被污染；柜内空气也需经过高效空气过滤器过滤后再排放到大气中以保护环境。

　II 级 A2 型生物安全柜：前窗操作口流入气流最小平均流速为 0.5m/s；柜内 70%气体通过高效空气过滤器过滤后再循环至工作区，30%气体通过排气口高效空气过滤器过滤后排出；安全柜内的污染气流经过高效空气过滤器过滤后经过生物安全柜的外排接口通过排风管排到大气中。

　七、标准操作：

　7.1 开机前先接通电源线，用钥匙打开生物安全柜的开关，按下电源按钮“Power supply”，电源指示灯亮 7.2 使用前，关闭前玻璃窗，按下进风开关按钮“Wind-in motor”、排风开关按钮“Wind-out motor”和紫外灯消毒开关按钮“Disinfect switch”,三个指示灯亮，消毒 30 分钟。

　7.3 按下紫外灯消毒开关按钮“Disinfect switch”，此灯灭，关闭紫外灯。按下照明灯开关按钮“Light switch”,照明指示灯亮，照明灯亮。打开前玻璃窗口，高度不能超过 20 厘米（超过即安全柜发出报警音）。

　7.4 使用时，将实验相关物品依次摆放于生物安全柜内，双臂缓缓伸入安全柜内，至少静止2min，使柜内气流稳定后再进行操作；操作时保证操作人员的脸部在工作窗口之上。在柜内操作时动作应轻柔、舒缓，防止影响柜内气流。

　7.5 操作完成后，关闭玻璃视窗，保持进风与排风继续运转，按下照明灯开关按钮“Light switch”，关闭照明功能，关灯；同时按下紫外灯消毒开关按钮“Disinfect switch”，打

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　文件编号：JYKPCR02002 版本/修订号：A/0 主题内容生物安全柜标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 13 页共 37 页开紫外灯，消毒 30min。

　7.6 消毒结束后，按下进风开关按钮“Wind-in motor”、排风开关按钮“Wind-out motor”、紫外灯消毒开关按钮“Disinfect switch”和电源按钮“Power supply”，用钥匙关闭电源，拔下电源线。

　7.7 附：生物安全拒操作面板示意图

　7.7 维护与保养 7.7.1 每次操作后用 75%的酒精彻底对安全柜内部工作区域表面、侧壁、后壁、窗户进行表面净化。切勿使用含有氯的杀菌剂，因为其可能对安全柜的不锈钢结构造成损坏。同时对紫外灯和电源输出口表面进行清洁。当清洁安全柜内部区域时，操作人员除了手放以外，身体的其他任何部位不能进入安全柜。

　7.7.2 每月用湿布对安全柜外部表面进行擦拭，尤其是安全柜的前面和上部，把堆积的灰尘打扫干净。并检查所有的维护配件的合理使用情况。

　 7.7.3 紫外灯使用超过 2000 小时后进行紫外灯的更换 7.7.4 每十八个月通知厂家更换高效空气过滤器，并对生物安全柜进行检修与维护

　8 8 、P SOP 文件的更改

　该标准操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人员提出并报请专业主管进行修改，科主任审核签字后生效。

　进风出风紫外灯照明电源

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　文件编号：JYKPCR03001 版本/修订号：A/0 主题内容 HBV- -A DNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 14 页共 37 页乙型肝炎病毒核酸定量检测标准操作程序一、目的

　规范乙型肝炎病毒核酸定量检测的操作。定量检测临床血清或血浆样本中的乙型肝炎（HBV）DNA，用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物的疗效观察。

　二、方法

　 PCR-荧光探针法三、原理

　采用核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆中的 HBV-DNA，利用针对 HBV 核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以 PCR 反应液，在荧光定量 PCR 仪上，应用实时荧光定量 PCR 检测技术，通过荧光信号的变化实现 HBV-PCR 的定量检测。

　四、标本要求

　4.1 标本类型

　血清或血浆、乳汁 4.2 标本要求 4.2.1 血清标本：无菌采血试管（红盖无添加物或黄盖含促凝剂试管）静脉采血 2.0ml。室温放置不超过 4 小时，3000rpm 离心 5 分钟分离血清，转移至 1.5ml 灭菌离心管中备用 4.2.2 血浆标本：EDTA 或枸橼酸钠抗凝无菌试管静脉采血 2.0ml，混匀。室温放置不超过 4小时，3000rpm 离心 5 分钟分离血清，转移至 1.5ml 灭菌离心管中备用 4.2.3 乳汁标本：无菌试管采集乳汁 2.0ml。室温放置不超过 4 小时，3000rpm 离心 5 分钟分离上清，转移至 1.5ml 灭菌离心管中备用 4.2.4

　如标本不能当晶检测，则需将转移至 1.5ml 灭菌管标本放于-20℃冷冻冰箱内保存，检测前再复融，标本严禁反复冻融五、仪器

　上海宏石医疗科技有限公司 SLAN@ 荧光定量 PCR 扩增仪六、试剂

　湖南圣湘生物科技有限公司乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒

　七、操作程序步骤

　1 7.1 试验前试剂准备：

　7.1.1 取出包装盒中的各组分，室温放置 30 分钟，待其温度平衡至室温后，混匀备用。

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　文件编号：JYKPCR03001 版本/修订号：A/0 主题内容 HBV- -A DNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 15 页共 37 页 7.1.2 根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品 A~D 数量，按比例（反应液 38ul/人份+酶混合液 2ul/人份）取相应量的反应液、酶混合液，充分混匀成 PCR-mix，瞬时离心后备用。

　7.2

　样本处理：

　7.2.1 打开电脑 LIS 系统，登录“免疫组（南院）”选择仪器“PCR_南院”，选择当天日期，对标本进行编号，同时对应标本号标本扫条码或手工输入病人标本信息。

　7.2.2 按标本要求对标本进行离心分离上清等处理；将阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D 进行瞬时离心，使其溶液沉降至管底。

　7.2.3 选择相应数量 PCR 反应管，每个 PCR 反应管中加入核酸释放剂 5ul（深吸浅打，避免出现气泡），然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品 A～D 各 5ul，吸打 5 次混匀（轻轻吸打，避免出现气泡）。

　7.2.4 放置 10 分钟以，每管加入 PCR-mix40ul，盖上管盖（可用手指弹击，去除气泡）。

　R 7.3

　PCR 扩增

　7.3.1 做好扩增仪检测前维护，打开扩增仪开关。

　7.3.2 双击 SLAN 8.0 图标，运行扩增仪软件 7.3.3 菜单新建实验文件，选择荧光检测通道：“通道 1：FAM,SYBR” 7.3.4 点击热盖按钮，热盖完成后，打开扩增仪上盖，将 PCR 反应管放入扩增仪样品槽，关闭上盖。

　7.3.5 编辑扩增模板：按样本槽内标本编号顺序设置样本、阴性对照、阳性对照、定量参考品，参考品属性栏内填入对应参考品浓度。

　7.3.6 基因扩增：打开扩增程序，选择 HBV-DNA 扩增程序文件：“SX-HBV.prg”，然后点击“开始实验” 4 7.4 循环参数设定

　步

　骤温度时间循环数 1 UNG 酶反应 50℃ 2 分钟 1 2 Taq 酶活化 94℃ 5 分钟 1 3 变性 94℃ 15 秒 45 退火，延伸，及荧光采集 57℃ 30 秒 4 仪器冷却 25℃ 10 秒 1 7.5 结果分析

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　作业指导书

　文件编号：JYKPCR03001 版本/修订号：A/0 主题内容 HBV- -A DNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 16 页共 37 页

　反应结束后自动保存结果，在实验结果模块下，结合模板模式、扩增曲线、标准曲线及报告模式中数据及各曲线，分析反应结果：

　7.5.1 HBV 阴性对照：无 Ct 值显示，定量结果<250。

　7.5.2 HBV 阳性对照：检测浓度值介于 1.26×105 ～1.26×10 6 IU/ml。

　7.5.3 四个 HBV 定量参考品：均检测为阳性，定量浓度值与给定值相符，且标准曲线相关系数 R2 ≥0.98。

　7.5.4 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

　S 7.6

　LIS 报告

　7.6.1 数据导出：菜单选择“导出实验结果”，文件名设为“1”，保存结果 7.6.2

　LIS 传输：桌面双击“LISMontor.exe”程序，打开 LIS 传输程序，点击“Getlnfo”按钮，数据传输至 LIS 系统中对应的标本号结果中 7.6.3 分析每一个病人结果，回顾近三个月的历史检测数据及相关检测数据，核准结果，发出检测报告。

　7.7 关机

　7.7.1

　热盖后打开扩增仪上盖，取出当晶检测样本，关闭扩增仪软件，LIS 软件，关闭扩增仪电源开关，关闭电脑 7.7.2 整理扩增仪、电脑工作台面，清洁扩增仪，做好检测后仪器维护八、参考值及检测限

　试剂盒给出检测下限为 1.0×102 IU/ml，内标 Ct 的参考值为 40。本实验室报告下限为<250。

　九、结果解释

　9.1 对于测定值在 5.0×102 ～5.0×10 9 IU/ml 之间的样本，且扩增曲线成明显 S 型，报告相应的测定结果。

　9.2 对于测定值>5.0×109 IU/ml 的样本，且扩增曲线成明显 S 型，报告注明>5.0×10 9 IU/ml。若需精确定量可根据结果，将样本稀释至 5.0×109 IU/ml 以下再复测。

　9.3 对于测定值≥2.5×102 IU/ml 而<5.0×10 2 IU/ml 的样本，且扩增曲线成明显 S 型，表明病毒载量低，可直接报告测定值，但注明：所测定量结果仅供参考。

　9.4 对于测定值<2.5×102 IU/ml 的样本，则报告 HBV-DNA 含量低于报告下限为<250 十、备注

　永州市中心医院南院检验科 R PCR 实验室

　作业指导书

　文件编号：JYKPCR03001 版本/修订号：A/0 主题内容 HBV- -A DNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 17 页共 37 页

　如在检测工作中出现异常情况，需联系仪器及试剂厂家

　上海宏石医疗科技有限公司：021-65107515

　湖南圣湘生物科技有限公司：073188883176 十一、P SOP 文件的更改

　该标准操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人员提出并报请专业主管进行修改，科主任审核签字后生效。

　永州市中心医院南院检验科 R PCR 实验室

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　文件编号：JYKPCR03002 版本/修订号：A/0 主题内容 EV71- -A RNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 18 页共 37 页肠道病毒 1 71 型核酸检测标准操作程序

　一、目的

　规范肠道病毒 71 型核酸定量检测（PCR-荧光探针法）的操作。定量检测咽拭子样本中的肠道病毒 71 型（EV-71）核酸，用于 EV71 感染的辅助诊断。

　二、方法

　 PCR-荧光探针法三、原理

　针对 EV71 核酸保守区设计特异性引物和特异性荧光探针，配以 RT-PCR 反应液，在荧光定量 PCR 仪上，应用实时荧光定量 PCR 检测技术，通过荧光信号的变化实现 EV71-RNA 的定量检测。

　四、标本要求

　4.1 标本类型

　咽拭子 4.2 标本要求 4.2.1

　标本处理相关耗材要求：1.5ml 离心管、吸嘴（10ul、200ul、1000ul）、扩增反应管（带盖）均需高压灭菌（121℃，30 分钟)处理 4.2.2 标本要求：咽拭子标本采样后，加 2ml 生理盐水，振荡器振荡 1 分钟混匀，1 小时内检测。如果 1 小时内无法检测，则需放于-20℃冷冻箱保存，检测时复融（只能复溶一次，严禁反复冻融）。

　五、仪器

　上海宏石医疗科技有限公司 SLAN@ 荧光定量 PCR 扩增仪六、试剂

　湖南圣湘生物科技有限公司肠道病毒 71 型（EV71）定量测定试剂盒

　七、操作程序步骤

　1 7.1 试验前试剂准备：

　7.1.1 取出包装盒中的各组分，室温放置 30 分钟，待其温度平衡至室温后，混匀离心备用。

　7.1.2 根据待测样本、阴性对照、阳性对照数量，按比例（RNA 提取液 1 600ul/人份+EV71内标 1ul/人份）取相应量的 RNA 提取溶液 1 及 EV71 内标，充分混匀成提取试剂 1-mix，瞬时离心后备用。

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　文件编号：JYKPCR03002 版本/修订号：A/0 主题内容 EV71- -A RNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 19 页共 37 页 7.1.3 根据待测样本、阴性对照、阳性对照数量，按比例（PCR 反应液 43ul/人份+EV71 酶混合液 2ul/人份）取相应量的 EV71 PCR 反应液及酶混合液，充分混匀 PCR-mix，瞬时离心后备用。

　7.2 样本处理：

　7.2.1

　打开电脑 LIS 系统，登录“免疫组（南院）”选择仪器“PCR_南院”，选择当天日期，对标本进行编号，同时对应标本号标本扫条码或手工输入病人标本信息。

　7.2.2 取适量 1.5ml 灭菌离心管，分别标记样本编号，阴性对照、阳性对照。每管加入 200ul待测标本及阴、阳性对照，600ul RNA 提取液 1-mix，然后再加入 100ul RNA 提取液 2，震荡10 秒充分混匀。

　7.2.3 将离心管放入加热器，58℃放置 10 分钟，然后置于 2-8℃冰箱内放置 10 分钟 7.2.4 将离心管瞬时离心（即达到 1000rpm 时立即停止离心），将离心管置于磁珠分离器上3 分钟（离心管开品面向操作者）

　7.2.5 在磁珠分离器上将离心管内溶液吸出（由上向下，避免碰到离心管壁上的棕色物质）

　7.2.6 每管加入 600ul RNA 提取液 3，然后再加入 200ul RNA 提取液 4，震荡 10 秒充分混匀 7.2.7 将离心管瞬时离心，将离心管置于磁珠分离器上 3 分钟 7.2.8 在磁珠分离器上将离心管内溶液吸出（由上向下，避免碰到离心管壁上的棕色物质），静置 1 分钟后将管底残留余液再次吸出丢弃 7.2.9 每个离心管加入 30ul RNA 洗脱液，将离心管壁上的磁珠充分洗脱到管底，吸打混匀 5次，室温静置 10 分钟，然后将离心管再次放置于磁珠分离器上 3 分钟。

　7.2.10 根据样本、阴、阳性对照数量选择相应数量的 PCR 反应管，每个反应管加入 45ul PCR-mix 7.2.11 每个 PCR 反应管内再加入磁珠分离器上离心管内洗脱下的 RNA 混合液（注意不能磁到离心管壁上的磁珠）5ul，最后将 PCR 反应管加盖 R 7.3 PCR 扩增

　7.3.1 做好扩增仪检测前维护，打开扩增仪开关 7.3.2 双击 SLAN 8.0 图标，运行扩增仪软件 7.3.3 菜单新建实验文件，选择荧光检测通道：“通道 1：FAM,SYBR”和“通道 2：HEX,VIC,JOE,TET”

　永州市中心医院南院检验科 R PCR 实验室

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　文件编号：JYKPCR03002 版本/修订号：A/0 主题内容 EV71- -A RNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 20 页共 37 页 7.3.4 点击热盖按钮，热盖完成后，打开扩增仪上盖，将 PCR 反应管放入扩增仪样品槽，关闭上盖。

　7.3.6 编辑扩增模板：按样本槽内标本编号顺序设置样本、阴性对照、阳性对照、。

　7.3.7 基因扩增：打开扩增程序，选择 EV71-RNA 扩增程序文件：“SX-EV71.prg”，然后点击“开始实验” 4 7.4 循环参数设定

　步骤温度时间循环数 1 预变性和酶激活 95℃ 1 分钟 1 2 逆转录 50℃ 30 分钟 1 3 cDNA 预变性 95℃ 1 分钟 1 4 变性 95℃ 15 秒 45 退火，延伸，及荧光采集 30℃ 30 秒 5 仪器冷却 25℃ 10 秒 1 7.5 结果分析

　反应结束后自动保存结果，在实验结果模块下，结合模板模式、扩增曲线及报告模式中数据及各曲线，分析反应结果：

　7.5.1 EV71 阴性对照：无 Ct 值显示，但内标检测为阳性，且 Ct 值<37.5。

　7.5.2 EV71 阳性对照：检测 Ct 值<37.5,内标检测为阳性，且 Ct 值<37.5。

　7.5.3 每一个检测样本的内标检测为阳性，且 Ct 值<37.5 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

　S 7.6 LIS 报告

　7.6.1 记录每一个阳性检测样本的 Ct 值，手工输入 LIS 系统中，阴性检测样本，LIS 系统默认为 Ct 值<37.5 7.6.2 核对每一个结果，注意 LIS 系统中是否有历史结果，回顾性分析检测结果，核准所有结果，发出报告 7.7 关机

　7.7.1

　热盖后打开扩增仪上盖，取出当晶检测样本，关闭扩增仪软件，LIS 软件，关闭扩增仪电源开关，关闭电脑

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　文件编号：JYKPCR03002 版本/修订号：A/0 主题内容 EV71- -A RNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 21 页共 37 页 7.7.2 整理扩增仪、电脑工作台面，清洁扩增仪，做好检测后仪器维护八、参考值

　试剂盒给出 EV71 的 Ct 值为 36，检测内标 Ct 的参考值为 36.本实验室所定的参考值为:Ct值<37.5 九、结果解释

　9.1 对于测定 Ct 值<37.5 样本报告为 EV71-RNA 阳性。

　9.2 对于测定 Ct 值>37.5 或无 Ct 值的样本，同时内标检测为阳性，且 Ct 值<37.5，则报告为EV71-RNA 阴性 9.3 当检测样本中内标检测 Ct 值>37.5 时，则该样本检测结果无效，需查找并排除原因，并对此样本进行复检（如复检仍无效，则需与试剂厂家联系，并保存好当日标本）

　十一、备注

　如在检测工作中出现异常情况，需联系仪器及试剂厂家上海宏石医疗科技有限公司：021-65107515 湖南圣湘生物科技有限公司：073188883176 十一、P SOP 文件的更改

　该标准操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人员提出并报请专业主管进行修改，科主任审核签字后生效。

　永州市中心医院南院检验科 R PCR 实验室

　作业指导书

　文件编号：JYKPCR03002 版本/修订号：A/0 主题内容 HCV- -A RNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 22 页共 37 页

　丙型肝炎病毒 A RNA 检测标准操作程序

　一、目的

　规范丙型肝炎病毒 RNA 定量检测（PCR-荧光探针法）的操作。定量检测临床血清或血浆样本中的丙型肝炎病毒（HCV）RNA，用于丙型肝炎的辅助诊断。

　二、方法

　 PCR-荧光探针法三、原理

　采用磁珠法提取样品中的丙型肝炎病毒 RNA，利用针对丙型肝炎病毒核酸保守区设计的特异性引物和荧炮控针，配以 PCR 反应液，在荧光定量 PCR 仪上，应用实时荧光定量 PCR 检测技术，通过荧光信号的变化实现丙型肝炎病毒 RNA 的定量检测。

　四、标本要求

　4.1 标本类型

　血清或血浆样本 4.2 标本要求 4.2.1

　标本处理相关耗材要求：1.5ml 离心管、吸嘴（10ul、200ul、1000ul）、扩增反应管（带盖）均需高压灭菌（121℃，30 分钟)处理 4.2.2 标本要求：样本采集后应尽快离心样本进行检测，室温下不超过 4 小时。如果不能即时检测，需将离心后样本转移至灭菌离心管内置于-20℃±5℃冰箱内保存，30 天内检测完毕。

　五、仪器

　上海宏石医疗科技有限公司 SLAN@ 荧光定量 PCR 扩增仪六、试剂

　湖南圣湘生物科技有限公司肠道病毒丙型肝炎病毒 RNA 定量测定试剂盒

　七、操作程序步骤

　1 7.1 试验前试剂准备：

　7.1.1 取出包装盒中的各组分，室温放置 30 分钟，待其温度平衡至室温后，混匀离心备用。

　7.1.2 根据待测样本、阴性对照、阳性对照及参考品数量，按比例（RNA 提取液 1 600ul/人份丙型肝炎病毒内标 0.4ul/人份）取相应量的 RNA 提取溶液 1 及丙型肝炎病毒内标，充分混匀成提取试剂 1-mix，瞬时离心后备用。

　永州市中心医院南院检验科 R PCR 实验室

　作业指导书

　文件编号：JYKPCR03002 版本/修订号：A/0 主题内容 HCV- -A RNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　 23 第 23 页共 37 页 7.1.3 根据待测样本、阴性对照、阳性对照及参考品数量，按比例（PCR 反应液 49ul/人份+增强剂 1ul/人份）取相应量的丙型肝炎病毒 PCR 反应液及 RT-PCR 增强剂，充分混匀 PCR 混合液，瞬时离心后备用。

　7.2 样本处理：

　7.2.1

　7.2.2 取适量 1.5ml 灭菌离心管，分别标记样本编号，阴性对照、阳性对照及参考品。每管加入 200ul 待测标本及阴、阳性对照及参考品，600ul RNA 提取液 1-mix，然后再加入 100ul RNA 提取液 2，震荡 10 秒充分混匀后室温静置 30 分钟。

　7.2.3

　将离心管瞬时离心（即达到 1000rpm 时立即停止离心），将离心管置于磁珠分离器上3 分钟（离心管开品面向操作者）

　7.2.4 在磁珠分离器上将离心管内溶液吸出（由上向下，避免碰到离心管壁上的棕色物质）

　7.2.5 每管加入 600ul RNA 提取液 3，然后再加入 200ul RNA 提取液 4，震荡 10 秒充分混匀 7.2.6 将离心管瞬时离心，将离心管置于磁珠分离器上 3 分钟 7.2.7 在磁珠分离器上将离心管内溶液吸出（由上向下，避免碰到离心管壁上的棕色物质），静置 1 分钟后将管底残留余液再次吸出丢弃 7.2.8 每个离心管加入 50ul PCR 混合液，将离心管壁上的磁珠充分洗脱到管底，吸打混匀。盖上管盖，上机检测 R 7.3 PCR 扩增

　7.3.1 做好扩增仪检测前维护，打开扩增仪开关 7.3.2 双击 SLAN 8.0 图标，运行扩增仪软件 7.3.3 菜单新建实验文件，选择荧光检测通道：“通道 1：FAM,SYBR” 7.3.4 点击热盖按钮，热盖完成后，打开扩增仪上盖，将 PCR 反应管放入扩增仪样品槽，关闭上盖。

　7.3.6 编辑扩增模板：按样本槽内标本编号顺序设置样本、阴性对照、阳性对照、参考品及其属性（即参考品浓度）。

　7.3.7 基因扩增：打开扩增程序，选择丙型肝炎病毒 RNA 扩增程序文件：“SX-HCV.prg”，

　永州市中心医院南院检验科 R PCR 实验室

　作业指导书

　文件编号：JYKPCR03002 版本/修订号：A/0 主题内容 HCV- -A RNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　 24 第 24 页共 37 页然后点击“开始实验” 4 7.4 循环参数设定

　步骤温度时间循环数 1 预变性和酶激活 95℃ 1 分钟 1 2 逆转录 60℃ 30 分钟 1 3 cDNA 预变性 95℃ 1 分钟 1 4 变性 95℃ 15 秒 45 退火，延伸，及荧光采集 30℃ 30 秒 5 仪器冷却 25℃ 10 秒 1 7.5 结果分析

　反应结束后自动保存结果，在实验结果模块下，结合模板模式、扩增曲线及报告模式中数据及各曲线，分析反应结果：

　7.5.1 HCV 阴性对照：无 Ct 值显示，但内标检测为阳性，且 Ct 值<38。

　7.5.2 HCV 阳性对照：检测浓度值范围为：1.58E+02-1.58E+03IU/mL。

　7.5.3 每一个检测样本的内标检测为阳性，且 Ct 值<38 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

　S 7.6 LIS 报告

　7.6.1 记录每一个阳性检测样本的 Ct 值，手工输入 LIS 系统中，阴性检测样本，LIS 系统默认为检测结果低于检测下限，即<25. 7.6.2 核对每一个结果，注意 LIS 系统中是否有历史结果，回顾性分析检测结果，核准所有结果，发出报告 7.7 关机

　7.7.1

　热盖后打开扩增仪上盖，取出当晶检测样本，关闭扩增仪软件，LIS 软件，关闭扩增仪电源开关，关闭电脑 7.7.2 整理扩增仪、电脑工作台面，清洁扩增仪，做好检测后仪器维护八、参考值

　试剂盒给出检测下限为 25IU/mL，内标 Ct 参考值为≤38

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　文件编号：JYKPCR03002 版本/修订号：A/0 主题内容 HCV- -A RNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　 25 第 25 页共 37 页九、结果解释

　9.1 对于测定值在 5.0×102 ～1.0×10 8 IU/ml 之间的样本，且扩增曲线成明显 S 型，报告相应的测定结果。

　9.2 对于测定值>1.0×108 IU/ml 的样本，且扩增曲线成明显 S 型，报告注明>1.0×10 8 IU/ml。若需精确定量可根据结果，将样本稀释至 1.0×108 IU/ml 以下再复测。

　9.3 对于测定值≥2.5×102 IU/ml 而<5.0×10 1 IU/ml 的样本，且扩增曲线成明显 S 型，表明病毒载量低，可直接报告测定值，但注明：所测定量结果仅供参考。

　9.4 对于测定值<2.5×102 IU/ml 的样本，则报告 HCV-DNA 含量低于报告下限为<25. 十二、备注

　该标准操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人员提出并报请专业主管进行修改，科主任审核签字后生效。

　永州市中心医院南院检验科 R PCR 实验室

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　文件编号：JYKPCR03002 版本/修订号：A/0 主题内容 HPV- -A DNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 26 页共 37 页

　高危型人乳头状瘤病毒（ HPV ）核酸检测

　 1 目的：

　规范临床基因扩增实验室对临床标本的处理，提高检测结果的准确率。

　2 适用范围：

　14 种高危型人乳头状瘤病毒（HPV）核酸检测试剂盒。

　3 职责：

　由临床基因扩增实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，检验所总负责人批准实施。

　4 检测原理：

　本试剂盒基于采用 Taqman 荧光探针结合多重荧光 PCR 技术，通过实时荧光 PCR 仪，进行同步核酸扩增与检测。可在同一反应管中通过仪器四种荧光检测通道分别检测 12 种高危型 HPV（31， 33， 35， 39， 45， 51， 52， 56， 58， 59， 66， 68），HPV16、HPV18及细胞内对照 β-globin DNA。细胞内对照 DNA 用于评估样本质量及 PCR 抑制因素。

　5 适用标本类型：

　本试剂盒适用于男性泌尿生殖道分泌物或者女性尿道分泌物的棉拭子、女性宫颈脱落细胞样本以及男女性疣体的样本。

　6 标准操作程序：

　6.1 扩增试剂准备 6.1.1 从-20℃保存的试剂盒中取出 PCR MIX，4℃避光下平缓解冻，上下颠倒混匀后，点动离心；将-20℃保存的 Taq 酶管取出必须点动离心。

　6.1.2 建议对 48 人份/盒扩增检测试剂进行一次性分装。将 Taq 酶全部加入到 PCR MIX 中去，并再吸取 PCR MIX 到 Taq 酶管里润洗 2 遍，保证 Taq 酶尽可能多的加到 PCR MIX 中。充分震荡混匀 PCR MIX，在微型离心机上点动离心备用。

　永州市中心医院南院检验科 R PCR 实验室

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　文件编号：JYKPCR03002 版本/修订号：A/0 主题内容 HPV- -A DNA 检测标准操作程序

　生效日期：20151010

　第 27 页共 37 页

　6.1.3 取出 48 人份 PCR 八联管或者单管，在 PCR 管架上进行排列，将移液器调至 18ul 后将混合好的 PCR 反应液分装到 0.2ml PCR 管中。取出当天需要的实验的数量，通过传递窗传送到标本制备区，放于 4℃冰箱备用，其余的放入-20℃的试剂准备区的冰箱保存备用（试剂尽量避光，勿多次反复冻融）。

　注：如需要每次单独分装的，可参照以下附表计算使用量，但需要在计算后的基础上增加 1%—2%的消耗量。

　PCR-Mix DNA Taq 1 人份用量 17.5μl 0.5 μl 10 人份用量 175 μl 5 μl 20 人份用量 350 μl 10 μl 48 人份用量 840 μl 24μl 6.2 宫颈脱落细胞 DNA 的提取：

　6.2.1 将临床样本震荡混匀，伸入采集管底部吸取临床样本 0.5ml-1ml 至 1.5ml 的离心管中。（如果细胞数量少可以加大体积到 2ml。）

　6.2.2 14000 转/分钟离心 1 分钟（此 1 分钟应为有效的离心时间，若升降速率较慢的离心机应相应增加离心时间），弃上清（可保留残液约 20μl）。

　6.2.2.1 对于血较多的临床标本，取细胞前在震荡器上震荡时间长些，离心收集细胞后，再用生理盐水多洗一次。

　6.2.2.2 对于黏液过多的临床标本，去细胞前在震荡器上震荡的时间长些，不要取黏液，将取样刷头取出，吸取瓶底部液体。另要求医生在取样时尽量规范，先用棉签把黏液擦去再进行取样。

　6.2.3 加入 0.5ml 细胞保存液振荡重悬细胞，14000 转/分钟离心 1 分钟（此 1 分钟应为有效的离心时间，若升降速率较慢的离心机应相应增加离心时间），尽量去尽全部上清。

　6.2.4 每样本加入 50ul 细胞裂解液，充分震荡重悬细胞，煮沸 10 分钟。

　6.2.5 14000 转/分钟离心 10 分钟，取上清（上清中为...

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