天冬药材基因组DNA提取方法研究

　　摘要 [目的]从天冬药材中提取可用于RAPD扩增的高质量基因组DNA。[方法]分别采用改良CTAB法、SDS法以及植物基因组DNA提取试剂盒法提取天冬药材基因组DNA；通过电泳、DNA浓度与纯度检测以及RAPD扩增效果确定天冬药材基因组DNA的最佳提取方法。[结果]CTAB法提取的基因组DNA较完整，DNA浓度与纯度均较高，可获得丰富的、清晰的RAPD條带。[结论]CTAB法为天冬药材基因组DNA提取的最佳方法，提取的DNA可用于天冬RAPD分析，该方法可为其他药材基因组DNA提取提供参考。
　　关键词 天冬；药材；基因组DNA提取；RAPD
　　中图分类号 S567.23 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）08-0171-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.045
　　Abstract [Objective]The research aimed to extract highquality genomic DNA which was used for RAPD amplification from herbal pieces such as ASPARAGI RADIX. [Method]Different methods， CTAB method， SDS method and DNA secure Plant Kit method were used to genomic DNA extract from ASPARAGI RADIX.The DNA samples obtained by the above methods were tested by agarose gel electrophoresis， concentration and purity of DNA and RAPD amplification. [Result]The more profuse and clear RAPD bands were obtained with random primers S7 by using improved CTAB. [Conclusion]CTAB method and RAPD reaction system can be used to RAPD analysis in ASPARAGI RADIX，which can provide certain reference for the extraction of genomic DNA of Chinese traditional medicine.
　　Key words ASPARAGI RADIX；Medicinal materials；Extraction of genomic DNA；RAPD
　　天冬（ASPARAGI RADIX）为百合科植物天冬Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.的干燥块根，主要含有多糖、皂苷等成分[1-3]，具有养阴润燥、清肺生津等功效，用于肺燥干咳、内热消渴、肠燥便秘、热病津伤等[4]，为乌鸡白凤丸、二冬膏、党参固本丸、冬白梅片、咽炎片等著名制剂的主要原料药材。天冬在我国分布较广泛，其主产于广西、贵州、云南等地，并以贵州产的天冬质量最好[5]。
　　近年来，DNA分子标记鉴定技术相对于传统经验鉴别而言，具有遗传稳定性、遗传多样性、化学稳定性等特点，被广泛用于中药基源鉴定、道地性研究、植物分类中，而快速、有效地提取高质量的基因组DNA成为中药材分子鉴定的关键。由于大多数中药资源分布较为广泛，其DNA分析标记鉴定研究材料多采用新鲜幼嫩叶片，不同分布地域新鲜幼嫩叶片采集较困难。而商品中药材多为干品，其在加工、贮藏过程中，如日晒、高温烘干等会造成DNA的降解；其次，中药材不同药用部位中的多糖、脂质、色素、酚类和其他次生代谢产物会影响基因组DNA的提取[6]。因此，该研究以市售商品药材天冬为样品进行DNA提取方法研究，以期获得高质量的商品天冬基因组DNA，为中药材分子标记技术研究提供参考依据，也为后期基于DNA分子标记鉴定技术的天冬药材质量与遗传多样性的相关性研究奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 试材 天冬药材购于贵阳市花果园药材市场和贵阳市万东桥药材市场，经贵州医科大学覃容贵教授鉴定为百合科植物天冬Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.的干燥块根，标本存放于贵州医科大学中药材质量研究室。
　　1.2 试剂 DP-320新型植物基因组DNA提取试剂盒（北京TIANGEN生化科技有限公司）；DNA Marker DL2000；2×Taq PCR MasterMix；GoldView Ⅰ 核酸染色剂；CTAB；SDS；β-巯基乙醇；50×TAE缓冲液；平衡酚；氯仿；异戊醇；醋酸钠；TGL-16G台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；DYY-12C电泳仪（北京市六一仪器厂）；L96G型PCR扩增仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；Bio-Rad凝胶成像系统（美国）；电子分析天平（型号A-L-204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；电热恒温水浴锅（型号DK-98-Ⅱ）；XH-B型漩涡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）；无水乙醇等均为分析纯，水为蒸馏水。
　　1.3 方法
　　1.3.1 天冬基因组DNA的提取。
　　1.3.1.1 改良 CTAB 法[7-8]提取天冬药材DNA。称取天冬粉末100 mg置于研钵中，加入液氮研磨成细粉，将细粉转移至1.5 mL EP管中，加入600 μL 65 ℃预热的2%CTAB提取液和2 μL β-巯基乙醇，混匀。再加入6 μL RNA酶，上下颠倒混匀，于65 ℃水浴1 h，期间每20 min颠倒混匀1次。取出冷却至室温，12 000 r/min离心10 min，取上清液置新的离心管中，加入等体积的酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25∶24∶1），混匀，12 000 r/min离心10 min，取上清液，加入等体积的三氯甲烷∶异戊醇（24∶1），离心10 min，取上清液，再次加入等体积的三氯甲烷∶异戊醇（24∶1），离心10 min。将上清液加入到EP管中，并加入1/3体积的NaAC溶液和1 mL -20 ℃预冷的无水乙醇，于-20 ℃放置3 h，取出12 000 r/min离心15 min，弃上清液，用75%乙醇洗涤2次，晾干乙醇，加入50 μL TE溶剂溶解DNA，置于-20 ℃保存，备用。

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