常用药材中去甲乌药碱的LC—MS/MS测定方法研究

　　摘要：该文建立常用药材中去甲乌药碱的LC-MS/Ms测定方法。采用Hypersil Gold-C18柱（100mmx2.1mm，3μm）为色谱柱，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，进行梯度洗脱，流量为0.3mL/min；质谱采用电喷雾电离（ESI+）模式离子化，选择反应监测模式（SRM）扫描。结果表明：去甲乌药碱在3.05～122ng/mL的浓度范围内线性关系良好（y=1 530.85x-153.164，r=0.9993）；检测限和定量限分别为0.6，3ng/mL；重复性精密度和中间精密度分别为4.08%和4.73%；平均加样回收率为86.98%；22种常用中药材中仅有4种药材检测出去甲乌药碱，含量（μg/g）分别为细辛（8.66）>黄柏（8.216）>花椒（5.010）>地肤子（4.66）。所建分析方法可快速、灵敏、准确地定量中药材中去甲乌药碱，并提示部分中药材和食材中存在去甲乌药碱，运动员应慎用。
　　关键词：去甲乌药碱；Lc-MS/MS；中药材；兴奋剂
　　0引言
　　去甲乌药碱（higenamine，HG）属于苄基异喹啉类生物碱，是存在于乌头、附子、莲子心等中药材中的强心活性成分。HG能够刺激B受体，通过减少血小板黏附、抑制iNOS和上调HO-1的表达，对心血管产生正力、正时性作用，增加心输出量和心率，降血压；因此，临床上常被用作强心药。由于近年在運动场上偶有HG阳性发现，为确保运动员健康，世界反兴奋剂机构（world anti-doping agency，WADA）在《2017年禁用清单国际标准》中将HG明确列为β₂：激动剂类禁用物质。然而，HG广泛分布于植物甚至是一些食材中，如减肥产品、能量饮料或运动机能的产品添加剂中常发现有HG的存在嗍，成为运动员误服HG的潜在风险。因此，必须提前避免运动员食用含HG的植物药材或食材。
　　关于HG的检测文献较少.常用的检测方法有HPLC-UV、法、HPLC-FLD法、HPLC-MS法等。其中常规的HPLC-UV法灵敏度偏低；柱前衍生荧光法，改善了灵敏度，但增加误差步骤：而采用LC-MS法具有灵敏度高、步骤少、选择性高等特点，目前已有用于体内HG的检测。为此，本文拟采用LC-MS/Ms联用技术，在选择反应监测（SRM）模式下，首次对常用中药材和食材中的HG进行定性和定量检测。研究运动员常用药材或食材中HG的分布规律，筛选出适合运动员使用的药材和食材，补充反兴奋剂领域的研究缺陷。
　　1实验部分
　　1.1仪器
　　Ultimate3000 UHPLC高效液相色谱仪（Dionex）-TSQ Quantum Ultra电喷雾三重四级杆质谱仪（Thermo Scientific）；Thcrlno Scientific Hypersil GoldC18色谱柱（100mmx2.1 mm，3μm）；XS205电子分析天平（Mettler Tdedo公司，感量0.01 mg）；KQ-500B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；5430离心机（德国Eppendorf公司）；200 μL、1000μL移液枪（德国Eppendoff公司）；超纯水制备仪（美国Milli-Q公司）。
　　1.2试剂与试药
　　去甲乌药碱对照品（98.4%，LC-MS专用，美国Cato Research Chemicals公司）；药材黄柏、花椒、细辛、地肤子、续断、延胡索、红花、血蝎、赤芍、芙蓉叶、木香、丁香、肉桂、川芎、独活、当归、羌活、大黄、川木香、没药、大血藤、白芷共22味药材，购于中药市场；甲酸（98%，LC-MS专用，百灵威科技有效公司）；甲醇（HPLC grade，Fisher Scientific）。
　　1.3对照品溶液的配制
　　准确称取去甲乌药碱对照品适量于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，于4℃下冷藏备用。
　　1.4供试品溶液的制备
　　本文以去甲乌药碱含量较高的细辛药材为目标，设计了甲醇浓度、提取时间、浸泡时间、药材粒度等对提取率的考察，最终确定药材的提取条件为：药材粉末（40目）约1.0g，精密称定，于锥形瓶中加入75%甲醇50mL，浸泡1h并超声提取0.5 h，离心15min（5000r/min），取上清液1mL于10mL量瓶中，加75%甲醇溶液至刻度，摇匀，取溶液适量用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液用于LC-MS/MS进样。
　　1.5仪器条件
　　1）色谱柱：Thermo Hypersil Gold（100mmx2.1mm，3μm）；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为甲醇，梯度洗脱流程见表1：流量：0.3mL/min；柱温：35℃：进样体积：5μL。
　　2）质谱条件
　　电喷雾电离源（ESI）；正离子扫描；选择反应监测（SRM）扫描模式；喷雾电压3 500kV；毛细管温度为350℃；氮气作为鞘气和辅助气，其中鞘气压力为35psi（1psi=6.895kPa），辅助气压力为10psi；氩气为碰撞气，碰撞压力为1.5retort（1Ton=133.322Pa）；母离子为m/z=272.2，定量离子为m/z=107.3，对应的碰撞能量为28eV。
　　在上述条件下，对照品以及样品的总离子流图分别见图1和图2，去甲乌药碱保留时间约为5.56min，其质谱图见图3。
　　1.6基质考察
　　取甲醇10mL，超声处理1 h，于5000r/min下离心15min，取上清液1mL于10mL容量瓶中，用50%甲醇定容，取适量用0.22μm的微孔滤膜过滤，用于LC-MS/MS进样，结果说明空白基质对去甲乌药碱的测定无干扰。
　　2方法学验证
　　2.1线性与检测限

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