HPLC法同时测定川芎药材中阿魏酸、咖啡酸的含量

　　[摘要] 目的 建立HPLC法同时测定川芎药材中阿魏酸和咖啡酸含量的方法。 方法 采用Kromasil -ODS（250mm×4.6mm，5?m）色谱柱，流动相为甲醇-0.5%醋酸水（35：65）；流速：1.0mL/min；检测波长：323nm。 结果 阿魏酸和咖啡酸的线性范围分别为：13.62～257.4mg/mL （r=0.9996）和29.40～515.7mg/mL （r=0.9995）；平均回收率（n=6）分别为阿魏酸96.6%（RSD=0.8%）和咖啡酸95.6%（RSD=0.5%）。 结论 该法操作简单，结果准确，重现性好，为全面评价不同产地川芎药材的质量提供方法。
　　[关键词] HPLC；阿魏酸；咖啡酸；川芎
　　[中图分类号] R917 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）21-102-03
　　川芎（Rhizoma Chuanxiong）为伞形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎，其所含主要有效成分有酚酸类、内酯类、生物碱和挥发油等[1]，广泛应用于临床治疗。目前，对川芎中成分的含量测定多集中在阿魏酸、藁本内酯和川芎嗪等的测定[2-4]。本研究将川芎药材中阿魏酸和咖啡酸两组分含量同时测定，并对不同产地的药材进行含量比较，以完善川芎的质量控制。
　　1 试剂与方法
　　1.1 仪器
　　Agilent-1100型高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器（DAD）、四元梯度泵、在线真空脱气机和柱温箱。超声波清洗器（DS3120 DC），RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
　　1.2 试剂
　　甲醇为色谱级，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。
　　1.3 试验用药
　　阿魏酸、咖啡酸对照品（自制，经HPLC检测质量分数均>99.0%）。川芎购自四川等10产地，经鉴定均为正品。
　　1.4 方法
　　1.4.1 溶液制备
　　1.4.1.1 对照品储备液的制备 分别取阿魏酸和咖啡酸对照品适量，用甲醇溶解，制成浓度分别为0.5008mg/mL和1.000mg/mL的对照品溶液。
　　1.4.1.2 供试品溶液的制备 选取不同产地的川芎药材，粉碎过筛后，分别精密称定粉末约1.0g，置锥形瓶中，然后加入0.5mol/L NaOH溶液50mL，超声提取20min，共提取3次，冷却，静置，离心，取上清液，用稀HCl调pH=2，然后用乙酸乙酯等量萃取3次，合并萃取液，使用旋转蒸发仪蒸干，用甲醇复溶并稀释至25mL量瓶中，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
　　1.4.2 色谱条件 色谱柱：Kromasil -ODS（250mm× 4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.5%醋酸水（35：65）；检测波长：320nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃。
　　2 结果
　　2.1 系统适用性试验
　　按照上述样品处理方法和色谱条件进行测定，两峰之间的分离度大于1.5；理论塔板数大于30 000；拖尾因子在0.95～1.05之间，均满足定量要求。色谱图见图1。
　　（B）
　　1.咖啡酸；2.阿魏酸
　　2.2 线性关系的考察
　　分别精密量取阿魏酸和咖啡酸对照品溶液适量，配成混合对照品系列溶液，按照上述色谱条件，进样分析，以各自的浓度X（μg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到阿魏酸和咖啡酸回归方程分别为：Y=5.339×104X+230.8，r=0.9996；Y=4.588×104X+470.2，r=0.9995。线性范围分别为：13.62～57.40μg/mL和29.40～515.7μg/mL。
　　2.3 精密度试验
　　取阿魏酸和咖啡酸的中浓度混合对照品溶液，按照1.4.2色谱条件，连续进样6次。分别测得阿魏酸和咖啡酸的峰面积，计算两组分峰面积的RSD分别为0.3%和0.5%，精密度良好。
　　2.4 重复性试验
　　取6份同一产地川芎药材粉末，精密称定，按照1.4.1项下处理，按1.4.2色谱条件，进样分析。阿魏酸和咖啡酸含量的RSD分别为0.2%和0.2%。
　　2.5 稳定性试验
　　取同一供试品溶液，室温放置，分别于0，2，4，6，8，12h，按照2.1项下处理，按2.2色谱条件，进样分析。阿魏酸和咖啡酸峰面积的RSD分别为0.7%和0.3%。结果表明供试品溶液在12h内稳定。
　　2.6 加样回收率试验
　　取同一产地已知含量的川芎药材粉末6份，加入已知浓度的混合标准品溶液适量，再加入0.5mol/L NaOH溶液至50mL，按照按2.2色谱条件进样分析并计算其加样回收率。阿魏酸和咖啡酸的平均回收率分别为96.6%和95.6%，RSD分别为0.9%和0.5%。见表1。
　　2.7 样品测定
　　取不同产地的川芎药材粉末精密称定1.00g，按照2.1项下处理，按2.2色谱条件，进行分析，分别计算阿魏酸和咖啡酸的含量，结果见表2。
　　3 讨论
　　3.1 提取条件的优化
　　本实验通过考察不同酚酸类成分的提取方法[5-8]，比较了甲醇、甲醇-水、甲醇-5%甲酸水、0.5mol/L NaOH溶液这4种不同的提取溶剂，氯仿、乙酸乙酯等2种不同的萃取溶液，对样品进行提取分析后进样分析，通过考察阿魏酸和咖啡酸的含量，从而选择了最佳的提取条件。
　　3.2 色谱条件的优化
　　本实验考察了3根不同的色谱柱，分别为Waters-C18（150mm×3.9mm，4μm）；Venusil XBP C18（L）（250mm×4.6 mm，5μm）和Kromasil -ODS （250mm×4.6mm，5μm），综合考虑选择Kromasil色谱柱。参考药典[9]选择检测波长为320nm，此波长可避免杂质干扰且可较好的检测该两组分。

相关热词搜索：川芎 测定 药材 含量 咖啡