光温条件对烟叶唇柱苣苔叶片离体培养的影响

　　基金项目 2013年海南省科学事业费项目“海南苦苣苔科植物2个特有种的引种栽培和快繁技术研究”（琼财预〔2013〕131号）。
　　
　　摘要以烟叶唇柱苣苔叶片为外植体，MS为基本培养基，研究了光照强度和温度对烟叶唇柱苣苔叶片离体培养的影响，以期筛选出各培养阶段最佳光照强度和温度。结果表明，叶片不定芽诱导的最佳光照强度是1 000 lx，最佳温度为28 ℃，40 d不定芽诱导率95.83%；不定芽增殖和生根的最佳光照强度是1 500 lx，最佳温度为28 ℃，40 d不定芽增殖倍数达7.24倍，生根率100.00%，平均生根数多达21.33条。
　　关键词烟叶唇柱苣苔；温光条件；叶片；不定芽；组织培养
　　中图分类号Q949.778.4；Q943.1文献标识码A文章编号 1007-5739（2014）11-0155-02
　　
　　烟叶唇柱苣苔（Chirita heterotricha Merr.）是苦苣苔科唇柱苣苔属多年生草本，生于海拔约430 m的山谷林中或溪边石上[1]，是海南省特有的野生花卉，具有极大的开发潜力。汤正辉对烟叶唇柱苣苔叶片不定芽的分化及生根进行了研究[2]，但有关光照及温度等环境条件在其离体培养中的影响未见有报道。本试验以烟叶唇柱苣苔无菌叶片作为试验材料，研究了不同光照强度和温度对叶片不定芽的分化、增殖以及生根的影响，以期筛选出各培养阶段最为合适的光照强度和温度。
　　1材料与方法
　　1.1试验材料
　　植株采自海南省保亭县，取幼叶作为外植体材料。供试植物生长调节剂为6-BA（6-苄基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）。基本培养基为MS。
　　1.2试验设计
　　以MS为基本培养基，根据试验目的添加植物生长调节剂6-BA和NAA，附加白糖30 g/L、卡拉胶9 g/L，灭菌前pH值为5.8，配制分装后，于温度121 ℃、压力0.14 MPa高温高压下灭菌20 min。材料接种后移入培养室，光照强度设置1 000、1 500、2 000 lx等3个处理，温度设置25、28、31 ℃ 3个处理，光照时间8 h/d，每个处理接种8袋，每袋3个材料，3次重复，定期观察记录，培养40 d后统计结果。
　　1.3试验方法
　　1.3.1无菌材料的建立。将烟叶唇柱苣苔的幼嫩叶片在自来水中洗去污物，用棉花蘸洗洁精液擦拭叶片两面，冲洗干净后移入超净工作台，先用75%酒精浸泡10 s，再用0.2‰ HgCl2溶液浸泡3 min，无菌水冲洗3次，最后用2%次氯酸钠溶液浸泡15 min，无菌水冲洗5次。将叶片切成1 cm×1 cm见方的小块，以叶背朝下接种于MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基上。接种15 d后，叶面开始膨大隆起，25 d开始有小芽点萌动，40 d在叶片边缘、主叶脉基部和叶面处均分化出不定芽。取不定芽叶片作为研究试验材料。
　　1.3.2不定芽的诱导。
　　（1）光照强度对叶片不定芽诱导的影响。取无菌植株小叶片（约0.5 cm×0.5 cm）以叶背接入MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基[2]，置于温度28 ℃、不同光照强度的培养室中，培养40 d后统计叶片不定芽诱导率和平均不定芽数。
　　（2）温度对叶片不定芽诱导的影响。取无菌植株小叶片（约0.5 cm×0.5 cm）以叶背接入MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基上，置于光照强度1 500 lx、不同温度的培养室中，40 d后统计叶片不定芽诱导率和平均不定芽数。
　　1.3.3不定芽的增殖。
　　（1）光照强度对不定芽增殖的影响。将单个不定芽接入MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中，置于温度28 ℃、不同光照强度的培养室中，培养40 d后统计不定芽增殖倍数。
　　（2）温度对叶片不定芽增殖的影响。将单个不定芽接入MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中，置于光照强度1 500 lx、不同温度的培养室中，40 d后统计不定芽增殖倍数。
　　1.3.4生根培养。
　　（1）光照强度对不定芽生根的影响。将高度达到1.2 cm的不定芽接入MS+NAA 0.5 mg/L培养基中，置于温度28 ℃、不同光照强度的培养室中，培养30 d后统计不定芽生根率、生根数、株高。
　　（2）温度对不定芽生根的影响。将高度达到1.2 cm的不定芽接入MS+NAA 0.5 mg/L培养基中，置于光照强度1 500 lx、不同温度的培养室中培养，30 d后统计不定芽生根率、生根数、株高和最长根。
　　1.4统计方法
　　计算公式为：不定芽诱导率（%）=诱导出芽叶片数/接种叶片数×100，平均不定芽数=不定芽总数/诱导出芽叶片数，不定芽增殖倍数=培养40 d不定芽总数/接种不定芽数，生根率（%）=生根植株数/接种植株数×100，生根数=植株生根总数/生根植株数。试验结果均进行方差分析，F测验显著后用新复极差法（SSR）进行多重比较，统计结果均为99%水平。
　　2结果与分析
　　2.1不定芽的诱导
　　（1）不同光照强度对烟叶唇柱苣苔叶片不定芽诱导的影响。由表1可知，光照强度1 000 lx时，烟叶唇柱苣苔不定芽诱导率和平均不定芽数最高，分别为95.83%和7.10个/叶，芽的生长势最好；光照强度为1 500 lx时，不定芽诱导率较低，为83.33%，平均不定芽数为5.50个/叶，芽生长势较差；光照强度2 000 lx时，不定芽诱导率最低为68.18%，平均不定芽数也最小为3.36个/叶，芽的生长势最差，可见光照强度高于1 000 lx时不利于芽的分化和生长，光照强度越高，诱导效果越差。方差分析结果表明，3种光照强度之间不定芽诱导率和平均不定芽数的差异达到极显著水平，因此烟叶唇柱苣苔叶片不定芽诱导的最适宜光照强度为1 000 lx。
　　（2）不同温度对烟叶唇柱苣苔叶片不定芽诱导的影响。由表2可知，培养温度28 ℃的不定芽诱导效果最好，不定芽诱导率最高，达到94.74%，平均每叶分化不定芽数最多，为7.34个，极显著高于其他处理；25 ℃的不定芽诱导率和平均不定芽数次之，与31 ℃的不定芽诱导率差异极显著，而平均不定芽数差异极不显著。从生长势看，28 ℃的不定芽生长势最好，25 ℃的次之，31 ℃的最差。因此，烟叶唇柱苣苔叶片不定芽诱导最佳温度为28 ℃。
　　
　　
　　
　　
　　
　　2.2不定芽增殖
　　（1）不同光照强度对烟叶唇柱苣苔不定芽增殖的影响。由表3可知，不同光照强度对烟叶唇柱苣苔不定芽增殖的影响极大，各处理间的差异达到极显著水平，其中1 500 lx的光照强度对不定芽的诱导生长效果最好，40 d不定芽增殖倍数达到7.24倍，极显著高于其他各处理，而且不定芽长势好，芽苗健壮，叶色深绿。1 000 lx的不定芽增殖倍数为6.66倍，极显著高于2 000 lx的增殖倍数，由此可见，烟叶唇柱苣苔不定芽的增殖不需要太强的光照，1 500 lx的光照强度最适宜不定芽的增殖与生长。
　　
　　
　　
　　
　　（2）不同温度对烟叶唇柱苣苔不定芽增殖的影响。由表4可知，在28 ℃温度下培养40 d，烟叶唇柱苣苔不定芽的增殖倍数最高，达到7.09倍，其次是25 ℃，增殖倍数为6.28倍，最低的是31 ℃，只有3.93倍。方差分析结果表明，25 ℃和28 ℃的增殖倍数差异极不显著，而二者与31 ℃的差异极为显著。从生长势看，25 ℃和28 ℃温度培养下，不定芽长势好，芽体健壮，31 ℃培养温度芽苗长势差、芽细、有较多的枯叶。因此，烟叶唇柱苣苔不定芽增殖与生长的适宜的温度为25~28 ℃，最佳温度为28 ℃。

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