单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌液相芯片检测方法的建立

　　摘 要：目的是建立一种快速检测单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌的液相芯片检测方法。采用基于间接竞争法的原理，将3种细菌抗原分别与不同的聚苯乙烯微球偶联，以藻红蛋白（PE）荧光标记二抗为信号，优化反应条件，对建立的方法进行灵敏度、特异性和可重复性验证。结果显示，3种细菌检测抗体最佳加入量分别为10ng、10ng、5ng，建立的方法检测单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌的最低检测限均可达到103 CFU/mL，检测其他常见食源性致病菌无交叉反应。结论表明，建立了一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的液相芯片检测方法，能够应用于实际样品的检测。
　　关键词：单增李斯特菌 副溶血弧菌 沙门氏菌 液相芯片 检测
　　前言
　　近年来，食源性疾病已成为世界上最突出、最广泛的食品安全问题，病原微生物引起的食源性疾病则是影响食品安全的最主要因素之一[ 1 ]。微生物性食物中毒事件主要由食物污染或变质、生熟交叉污染等原因引起，且气温较高、气候潮湿的环境适于细菌生长繁殖，导致食物易于腐败变质，一旦储存、加工不当，极易发生由沙门氏菌、副溶血性弧菌等微生物引起的食物中毒。现行检测手段已无法满足日常对食源性致病菌检测的需要，目前检验检疫工作中常用于检测和鉴定食源性致病菌的方法主要有PCR、Southem Blot杂交、酶联免疫吸附法（ELISA）等一些简单的分子生物学和免疫学方法[ 2 ]。现行的检测方法一般以检测致病菌为主，需要增菌培养，检测时间长，无法满足高通量的检测要求，远不能满足食品检测的需要，市场迫切需要能同时检测食源性致病菌的灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的高通量技术和方法[ 3 ]。因此，目前迫切需要发展一种快速、准确的方法来检测和追踪病原体和污染物的来源[4]。
　　液相芯片技术是在流式细胞技术、酶联免疫吸附技术和传统芯片技术基础上开发的新一代生物芯片技术和新型蛋白质研究平台，能同时检测多种致病菌。邱杨等[ 5 ]通过该法建立了对沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌的快速液相芯片检测方法，检测灵敏度达到50～100copies/mL。郭启新等[ 6 ]建立了对金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、志贺氏菌的检测方法，具有很好的特异性，检测灵敏度分别达38、44、21CFU/mL。Sun等[ 7 ]利用该法建立了高通量的同时检测6种食源性致病菌的方法，检测灵敏度达到20.4×103CFU/mL，远高于PCR。
　　但基于多重PCR的液相芯片技术对单管样本进行大量不同指标的高通量多重PCR方法建立仍存在困难，至今鲜见液相芯片用于检测多种致病菌方法建立的相关报道。将液相芯片技术应用到食源性致病菌检测中，可在短时间内实现对多个样品同时进行多种致病菌灵敏、准确的检测，因而有望大大提高食源性致病菌的检测效率，在有效控制食物中毒事件的发生、食品安全控制、海关进出口检验检疫、临床诊断等方面具有广阔的应用前景。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　Luminex 200液相悬浮芯片系统（美国Luminex公司）；4625型孔板振荡器；ST16R冷冻离心机（美国Thermo公司）；编号No.18、No.29、No.52的微球（美国Luminex公司）。活化缓冲液：0.1mol/L NaH2P04- N a2 HP04，pH6.2；磷酸盐缓冲液（PBS）：138mmol/L NaCI，2.7mmol/L KCl，8mmol/ L Na2HP04，1.5mmol/L KH2P04，pH7.4；洗涤缓冲液：PBS，0.05%Tween-20，pH7.4；分析缓冲液：PBS，1%BSA，pH7.4；封闭缓冲液：50mmol/L Tris，153mmol/L NaCl，2%BSA，0.05%Tween-20，pH7.4；储存缓冲液：PBS，0.1%BSA，0.02%Tween-20，0.05%叠氮化钠，pH7.4。菌种为本实验室保藏与西北农林科技大学食品实验室馈赠。
　　1.2 方法
　　1.2.1 微球偶联抗原
　　①取微球50μL（1.25×106个/mL）置于EP管，14000g离心4min，弃上清液。
　　②加入40μL活化缓冲液重悬微球，漩涡混合30s。
　　③加入50mg/mL NHS和EDC各5μL，混匀，避光室温下旋转混合600rpm，20min。
　　④加入150μL PBS，漩涡混合10s，14000g离心4min，弃上清液。
　　⑤用PBS洗涤3次后，加入150μL PBS重悬，再加入抗原，用PBS补齐至500μL，避光室温旋转混合600rpm，2h。
　　⑥14000g离心4min，弃上清液。
　　⑦加入150μL封闭缓冲液，漩涡混合15s，避光室温旋转混合600rpm，30min。
　　⑧16000g离心4min，弃上清液，加入100μL储存缓冲液4℃保存偶联的微球。抗原加入量为50ng。1.2.2 检测
　　①取出偶联微球，恢复至室温后漩涡30s。
　　②96孔板中加入100μL PBS预湿实验孔，抽去孔内液体，每孔中加入适量预混好的偶联微球（约2000个），用150μL PBS洗滌两次。
　　③将适量标准品或样品分别加入合适的孔中，空白孔加入等量PBS，再加入适量的抗体，用PBS补齐各孔至100μL。
　　④用移液器反复抽吸混匀孔内溶液，避光条件下37℃，600rpm振荡60min。
　　⑤反应完毕后，抽去孔内液体，用150μL PBS洗涤两次。
　　⑥每孔中加入100μL经适当稀释的PE标记二抗，移液器反复抽吸混匀。
　　⑦避光条件下，37℃，600rpm振荡45min后，抽去孔内液体，用150μL PBS洗涤两次。

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