姜黄素对大鼠脊髓损伤后神经元GAP—43表达变化的影响

　　【摘要】 目的：探讨姜黄素对大鼠脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后神经元神经生长蛋白43（growth associated protein，GAP-43）表达的影响。方法：制作SCI模型，分为假手术组、生理盐水治疗组、姜黄素治疗组，每组25只。用免疫组织化学染色检测神经元GAP-43的表达变化，检测动物术后BBB运动评分和斜板实验。结果：姜黄素治疗组较生理盐水治疗组，GAP-43含量较多，差异有统计学意义（P<0.05）；姜黄素治疗组的BBB运动评分和斜板实验明显优于生理盐水治疗组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：姜黄素能够改善SCI区域的微环境，促进神经生长因子表达。
　　【关键词】 姜黄素； 脊髓损伤； GAP-43
　　doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.5.088 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2018）05-0171-02
　　姜黄素（Curcumin）是从姜黄、郁金、莪术、石菖蒲等根茎提取的一种黄色酸性植物多酚，具有抗氧化、抗炎、降血脂、抗凝、抗纤维化及抑制肿瘤生长等多种药理作用[1-3]。近年来研究发现，姜黄素可以通过抑制钙超载、抗蛋白质聚积改善神经损伤后的微环境，发挥神经保护作用[4]。这里笔者通过使用姜黄素治疗脊髓损伤，观察神经细胞GAP-43表达和神经功能恢复，探讨姜黄素对神经系统的保护机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物和试剂
　　1.1.1 动物 选取75只体重250～300 g的SD雌性大鼠，动物随机分三组，即假手术组、生理盐水治疗组和姜黄素治疗组，每组25只。
　　1.1.2 试剂 姜黄素、GAP-43抗体、生物素化羊抗小鼠IgG、ABC试剂。
　　1.2 动物模型
　　脊髓损伤模型：腹腔注射戊巴妥钠麻醉大鼠，四肢固定在实验台上，切开后背正中皮肤，分离皮下组织和肌肉，咬除T9～T10棘突和椎板，露出脊髓组织，用手术刀快速向一侧半切断脊髓，冲洗缝合伤口，注射抗生素预防感染。
　　姜黄素治疗组每天给予腹腔注射姜黄素100 mg/kg，1周后停药[5]，生理盐水治疗组用0.9%Nacl代替姜黄素，假手术组仅给予抗感染治疗。
　　1.3 取材和切片
　　术后1、3、7、14、21 d每组各处死5只动物取材。腹腔注射戊巴妥钠麻醉大鼠，剪开胸腔，将针头从左心室插入至升主动脉，迅速切开右心房，快速灌注0.9%Nacl 250 ml，待液体清亮立刻灌注4%多聚甲醛300 ml，咬除棘突和椎板，暴露脊髓组织，取损伤区脊髓组织，行石蜡包埋切片。
　　1.4 免疫组织化学染色
　　切片滴加GAP-43抗体，放置4 ℃过夜，PBS洗3次，每次5 min；滴加生物素化羊抗小鼠IgG，4 ℃孵育12 h，PBS洗3次，每次5 min，滴加ABC试剂，DAB染色，苏木素复染。
　　镜下观察到黄色神经细胞即为GAP-43阳性细胞，每只动物取5张切片，计数阳性细胞总数，取每个时相5例动物的平均值。
　　1.5 行为学评价方法
　　采用斜板试验、BBB运动评分测试动物肢体运动情况[6-7]。
　　1.6 统计学处理
　　利用SPSS行统计学分析。数据以（x±s）表示，采用单因素方差分析和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 GAP-43表达
　　在术后7、14、21 d姜黄素治疗组GAP-43表达水平高于生理盐治疗组，差异有统计学意义（P<0.01）。在术后1、3、7、14、21 d生理盐水治疗组GAP-43表达水平均高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　2.2 BBB运动评分结果
　　所有动物术前评分为21分，在术后3 d假手术组评分达到20分，功能基本恢复正常。在术后14 d姜黄素治疗组评分明显高于生理盐水治疗组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
　　2.3 斜板实验
　　术前动物斜板实验角度达70°～75°，术后斜板实验角度至20°，表明造模成功。术后7、14、21 d姜黄素治疗组斜板实验角度高于生理盐水治疗组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。
　　3 讨论
　　在脊髓损伤后的早期，适度的星形胶质细胞的胶质化可以通过物理和化学性重建中枢神经系统的整体性，关闭血脑屏障以减少炎症浸润，使感染和蔓延的细胞损伤最小化来稳定中枢神经系统的组织；而后转入继发性反应期星形胶质细胞由静止态转向活化态，并继续进入增殖态，数目增加、胞体肥大，并迁移到损伤处边缘，交织成网状形成胶质瘢痕，成为神经再生的屏障。GAP-43在神经系统发育过程中呈现高水平表达，它可以促进神经细胞生长椎基底部胞浆膜扩张处，对突触的形成与重建具有重要作用，具有促在神经细胞生长、发育、再生，是神经再生的标志性蛋白[8-10]。邹明明等[11]采用姜黄素治疗损伤的脊髓，发现它可以减少神经胶质酸性蛋白和硫酸软骨素蛋白多糖的大量表达，减轻了星形胶质细胞的反应性增生，缩小空洞和瘢痕，改善损伤区域的微环境，有利于脊髓断端轴突再生和残存神经细胞通过瘢痕区。通过BBB运动评分和斜板实验发现，姜黄素组和生理盐水组动物在损伤早期（1～3 d）的肢体运动能力和控制體位能力变化不明显，但是到了损伤中晚期（7～21 d）动物运动功能恢复情况出现明显改善，且以姜黄素组变化最为明显，此外GAP-43的表达水平在术后14～21 d呈现高水平表达。这主要是由于脊髓损伤后早期炎症介质大量释放、神经细胞大量凋亡、神经胶质细胞活化程度较低，导致局部微环境恶劣，神经再生修复能力较弱，但到了脊髓损伤后中晚期由于神经胶质细胞被大量激活形成胶质瘢痕，限制了炎症扩散，改变了损伤区域微环境，有利于细胞存活，但是也阻碍了神经再生修复[12]，而姜黄素不仅能抑制神经胶质细胞活化，阻碍了胶质瘢痕的形成，而且通过抗炎、抑制钙超载、抑制蛋白质聚积改善损伤区域的内环境，启动生长相关基因表达，促进神经再生修复。

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