蛋白质相互作用 [药物分子与蛋白质相互作用研究方法综述]

　　摘要：本文以近年来药物与蛋白质的结合研究为基础，对二者作用的研究方法作了回顾与总结，并简要对各种方法作一评论。 　　关键词：药物；蛋白质；研究方法 　　中图分类号：R977.6 文献标识码：A
　　
　　1 前言
　　
　　蛋白质在生物体内占特殊地位，它们是构成原生质的主要成分，在各种生命过程中起着重要作用。研究药物分子与蛋白质的作用，对理解蛋白质结构与功能的关系以及阐明药物动力学、耐药性和毒副作用的机理有重要意义。
　　目前，这方面的研究主要集中于药物分子与血清蛋白和血浆蛋白的作用，其中绝大多数是与人血清白蛋白（HSA）和牛血清白蛋白（BSA）的作用。白蛋白是主要的血清蛋白，可以和许多内源性和外源性化合物结合，通过形成复合物来完成血浆的功能。药物进入人体后，只有通过血浆的贮存和运输，才能达到病灶部位，发挥药效。随着科学技术和方法的引入，这方面的研究内容也在不断深入。
　　
　　2 近代研究方法
　　
　　2.1 光谱方法
　　蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸残基都具有特殊的光学活性。许多药物分子本身也具有光学活性，或与蛋白质分子结合后产生光学活性，因此用光谱方法通过蛋白质分子结合药物分子后结构的变化研究结合机理，是有效和广泛的方法。
　　药物与生物分子相互作用的研究，荧光光谱法是应用广泛的重要手段，它具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点。它能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，这些参数从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定，不但可以定量分析，还可以推断蛋白质分子在各种环境下的构象变化。蛋白质分子的内源荧光主要是由色氨酸发出的，根据Forster能量转移机理可求出结合蛋白质的药物分子距蛋白质分子中色氨酸的距离，由此推测药物与蛋白质结合的空间部位；可直接根据药物对其内源荧光的猝灭或增强程度来考察相互作用的机理和结合强度，根据相应公式求得结合常数及结合位点数；用药物分子与结合部位已知的探针来代替（即标记配体）竞争蛋白质结合部位，可确定药物分子对蛋白质构象的影响。所以，该方法在蛋白质分子构象研究中得到越来越多的应用。近年来，在荧光猝灭法的基础上，同步荧光法和三维荧光光谱法等新技术也发挥着重要作用。
　　紫外―可见光谱法也是研究药物分子与蛋白质相互作用机理最常用、最方便的方法。因为有效药物与蛋白质分子结合后，它们的吸收光谱会有一定的改变，出现吸收峰位移或谱峰宽度变化，由此可研究蛋白分子与药物间的结合强弱及结合机理。同时，共振拉曼光谱、红外光谱等光谱方法也应用于药物与生物大分子相互作用的研究。
　　在已报道的文献中，几种光谱方法常结合使用。如Kamat利用圆二色谱、荧光光谱和紫外光谱法相结合的方法研究了氟喹诺酮药物对BSA的荧光猝灭机制，用荧光猝灭法测得结合常数n与表观结合常数K，还根据非辐射能量转移理论求得BSA与氟喹诺酮药物之间的结合距离。BSA-氟喹诺酮药物二元体系的同步荧光光谱、紫外-可见吸收光谱和圆二色谱表明牛血清白蛋白的构象发生了变化。Tang等分别用共振光生物传感器、荧光光谱和分子对接模拟技术研究了柔红霉素与HSA的结合行为。实验发现，柔红霉素使HSA的内源荧光猝灭是静态过程，而且二者的结合受体系pH的影响。对接模型显示，结合位点都不处于HSA的经典结合位点。进一步分析表明，疏水作用、氢键和静电作用是二者结合的主要推动力。
　　
　　2.2 量热法
　　生物体新陈代谢的实质就是在有机体内的一系列化学反应，在这些过程中，有一部分能量不可避免会以热效应的形式表现，利用微量热手段对这些热效应做精密的测量与详细的讨论，就构成了生物化学热力学的研究内涵。此外，量热法对被研究体系的溶剂性质、光谱性质以及电化学性质等没有任何条件的限制，因而有独到之处。常用的微量热法有常规量热法和差示扫描量热技术（Differential Scanning Calorimetry， DSC）等，已经用于药物分子与蛋白质的相互研究中。
　　量热学可根据不同的结合模型，如位点结合模型、邻近排斥方程等，确定蛋白质与小分子相互作用的热力学参数和结合数。对于不同小分子与蛋白质的相互作用，它们的各种热力学参数和结合数不同，这种差异在分子识别上是很有用的，可以根据结合数和热力学参数来判断蛋白质与小分子的作用机理。
　　分子识别过程是一个很重要的生命过程。目前，国内外许多科学家正在致力于探索分子识别过程中的非共价键作用力，以便确定结合的特定性和效率。利用X-射线或NMR只能确定它们识别过程中的三维结构，不能得到识别过程中的能量变化。许多蛋白质-配体之间的相互作用表现在熵和热容方面有很大的变化，可以通过DSC来研究蛋白质-配体之间的相互作用量热学参数。利用DSC测定蛋白质-配体之间相互作用的热力学参数，可以通过建立模型，测定蛋白质变性前后配体的各种参数，从而计算得到蛋白质-配体之间相互作用的焓变和熵变及热容。Barone等人建立了一个热力学模型，利用DSC变性前后的温度变化，进一步通过各种数学变换，得到蛋白质与配体相互作用的焓变与热容。他们研究了2"CMP和3"CMP与RNAA酶相互作用的量热曲线，根据热力学模型，通过量热曲线得到它们相互作用的热力学参数，并根据这些参数讨论其识别过程的机理和电解质对这些热力学性质的影响。他们还进一步利用DSC研究了S-多肽和S-蛋白质、葡萄糖与酵母己糖激酶相互作用的量热曲线，利用他们所建立的模型进行分析，得到了一些有用的参数，为蛋白质间相互作用的机理研究提供了一种新的方法。有人利用DSC研究了人血清蛋白与脂肪酸相互作用的量热曲线，根据量热曲线计算得到了热力学参数，并根据这些热力学参数对它们的结合机理进行了探讨。
　　
　　2.3 核磁共振（NMR）技术
　　NMR是两种能够测定生物大分子三维空间结构的技术之一，是研究生物大分子的溶液结构、动力学及分子相互作用的重要工具。特别是在蛋白质的动力学方面，NMR技术具有其他技术无法比拟的优越性，可以在接近生物大分子的生理环境（温度、盐浓度、pH值等）下对其溶液进行研究，因而得到的结果更具有说服力。近年来，随着NMR技术的飞速发展，对其研究的生物大分子分子量的限制也从10 KDa以下提高到25 KDa，同时，利用这一技术研究生物大分子动力学的方法也有了较大突破。
　　NMR测定蛋白质结构的方法包括四大基本要素：结构测定的主要NMR参数NOE（nuclear overhauser effect）距离测定；核磁谱峰序列专一性归属；NMR结构计算及结构评价；数据收集的多维NMR技术。
　　
　　2.4 其它方法
　　电化学方法虽然在一定程度上受到电活性与否的限制，但对于吸收光谱比较弱、电子跃迁谱带与大分子吸收重叠的组分，无法用吸收光谱法研究的分子，却能用直接伏安法进行研究。此外，平衡渗析、粘度测定以及离心超过滤、高效液相色谱、微渗析、质谱、毛细管电泳等方法也应用于药物与蛋白质分子相互作用的研究。
　　
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