流感丸棒嘎药材中乌头碱限量检查方法学研究

　　【摘要】目的 增订流感丸中乌头碱限量检查方法。方法 采用薄层色谱法，高效液相色谱法，Sunfire-ODS C18柱（250 mm，4.6 mm）；柱温：30℃室温；流动相：以甲醇-0.1%三乙胺（65：35）为流动相；检测波长240 nm。理论板数按乌头碱峰计算均高于2000。结果 供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。流感丸中不含乌头碱、次乌头碱、新乌头碱，含有异叶乌头碱、苯甲酰异叶乌头碱、阿替新等生物碱，这三种生物碱毒性较小，如异叶乌头碱对小鼠LD50（静注）为180～190 mg/kg，为乌头类生物碱中毒性较低的种类。结论 通过对薄色谱鉴别项方法学验证，所增订的薄层色谱法方法可行，重现性良好，阴性无干扰；高效液相定性方法可行，重现性良好，分离度好，阴性无干扰，该方法可作为流感丸中乌头碱的定量控制。
　　【关键词】流感丸；乌头碱；薄层色谱；高效液相色谱
　　【中图分类号】R259 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2018.28..02
　　流感丸用于清热解毒，用于流行性感冒，流清鼻涕，头痛咳嗽，周身酸痈，炎症发烧等。本实验建立了流感丸中乌头碱的薄层色谱鉴别和效液相色谱定性测定方法
　　1 薄层色谱法
　　1.1 检测方法
　　取本品粉末15 g，置具塞锥形瓶中，加乙醇50 mL，加热回流2 h，滤过，滤液蒸干，残渣用2%盐酸溶液20 mL溶解，用三氯甲烷20 mL振摇提取，弃去三氯甲烷液，水液用碳酸氢钠试液调节PH值至8～9，用三氯甲烷振摇提取2次，15 mL/次，合并三氯甲烷液，用无水硫酸钠脱水，蒸干，残渣用甲醇溶解使成2 mL，作为供试品溶液。另取乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液，作为混合对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10 μL、混合对照品溶液5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-环己烷-乙酸乙酯-二乙胺（8：4：4：1）为展开剂，置氨蒸汽饱和20 min的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。
　　1.2 方法学考察
　　供试品溶液制备方法同上。
　　阴性样品溶液制备：按处方比例去除草乌、榜嘎药材，并按上述供试品溶液方法方法制备。
　　供试品提取方法及色谱条件的考察：方法中对不同极性提取溶剂进行了考察（乙醇、甲醇、异丙醇-乙酸乙酯），对不同提取方法进行了考察（冷浸、超声、回流），对不同提取时间进行了考察（1 h、2 h、3 h），考察了不同展开剂：三氯甲烷-环己烷-乙酸乙酯-二乙胺（8：4：4：1）、正己烷-乙酸乙酯-甲醇（6.4：3.6：1）。
　　1.3 结果
　　最后试验结果表明，采用加乙醇50 mL，加热回流2 h，滤过，滤液蒸干，残渣用2%盐酸溶液20 mL溶解，用三氯甲烷20 mL振摇提取，弃去三氯甲烷液，水液用碳酸氢钠试液调节PH值至8～9，用三氯甲烷振摇提取2次，15 ml/次，合并三氯甲烷液，用无水硫酸钠脱水，蒸干，残渣用甲醇溶解使成2 mL，展开剂用正己烷-乙酸乙酯（9：1），薄层板用硅胶G板，喷以稀碘化铋钾试液后在日光下检视的方法斑点分离良好，特征明显，阴性溶液无干扰。
　　1.4 检验结果
　　供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，3批样品均未显相同颜色的斑点，斑点分离良好，特征明显，阴性溶液无干扰，可作为流感丸中乌头碱限量检查的方法。
　　2 高效液相色谱法
　　流感丸原药材棒嘎药材中乌头碱定性测定研究
　　2.1 儀器与试药
　　2.1.1 仪器
　　Waters 2695型高效液相色谱仪，Waters 2487 DAD检测器，Empower Pro化学工作站；电子天平，德国赛多利斯股份公司）；电子天平；超声波清洗器。
　　2.1.2 试药
　　乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品，购自中国药品生物制品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。
　　2.2 方法与结果
　　2.2.1 色谱条件与系统适用性试验
　　参照《中国药典》[1]2010年版一部川乌、草乌中的乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的含量测定方法及随志刚等对草乌中乌头类生物碱提取方法比较研究，选择以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.1%三乙胺（65：35）为流动相；检测波长240 nm。理论板数按乌头碱峰计算均高于2000。
　　2.2.2 对照品溶液的制备
　　精密称取乌头碱对照品12.97 mg、次乌头碱对照品9.96 mg、新乌头碱对照品11.88 mg，分别置100 mL量瓶中，加异丙醇一三氯甲烷（1：1）混合溶液溶解，定容至刻度，即得乌头碱浓度为0.1281 mg/mL、次乌头碱浓度为0.0991 mg/mL和新乌头碱浓度为0.1170 mg/mL的溶液。
　　2.2.3 供试品溶液的制备
　　2.2.3.1 提取方法的考察
　　（1）方法一：取草乌药材粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇一乙酸乙酯（1：1）混合溶液50 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz；水温在25℃以下）30 min，放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯（1：1）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-三氯甲烷（1：1）混合溶液3ml溶解，滤过，取续滤液，即得。
　　（2）方法二：酸提法，取草乌药材粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.05 mol/L盐酸溶液50 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz；水温在25℃以下）30 min，放冷，再称定重量，用0.05 mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，于12000 r/min离心5 min，上清液滤过，取续滤液，即得。
　　（3）方法三：酸超声提乙醚萃取法，取草乌药材粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.05 mol/L盐酸溶液50 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz；水温在25℃以下）30 min，放冷，再称定重量，用0.05 mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，于12000 r/min离心5 min，取上清液，用10%氨水调pH值为10，加入15，5，5 mL乙醚萃取三次，合并乙醚层，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至25 mL，即得。
　　（4）方法四：氨水乙醚冷浸法，取草乌药材粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入40 mL10%氨水，加乙醚30 mL，振荡5 min，冷浸6 h，转移至50 mL离心管中，3000 r/min离心5 min，取乙醚层，沉淀用乙醚洗涤2次，10 mL/次，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至25 mL，即得。
　　3 讨 论
　　检测结果与所查文献结论一致，草乌中不含乌头碱、次乌头碱、新乌头碱，含有异叶乌头碱、苯甲酰异叶乌头碱、阿替新等生物碱[2]，这三种生物碱毒性较小，如异叶乌头碱对小鼠LD50（静注）为180～190 mg/kg[3]，为乌头类生物碱中毒性较低的种类。又加这三种生物碱对照品属于冷僻品种，我们多方求购，至今没有买到，故未能对这三种生物碱进行定量研究。
　　参考文献
　　[1]刘高宏，魏立莉.流感丸中乌头碱的限量检查及HPLC含量测定方法的建立[J].西部中医药，2016，29（11）：24-26.
　　[2]张有新，仇朝红，刘学良，等.流感丸中乌头碱含量测定研究[J].临床医药文献电子杂志，2017，4（38）：7497-7498.
　　[3]戴卫平，李 耿，申小花，等.众生丸对 H1N1流感小鼠的保护及免疫调节作用研究[J].环球中医药，2015，16（4）：395-399.
　　本文编辑：刘欣悦

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