中草药有效成分的高效提取及抑菌性检测

　　【中图分类号】R544.1 【文献标识码】B 【文章编号】2095-6851（2018）03--01
　　金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）是严重危害人类生命健康的一种重要病原菌，它是引起人类化脓感染中最常见的病原菌，可直接导致局部化脓感染、肺炎等疾病，甚至引发败血症、脓毒症等全身感染。[1]目前，临床上用于治疗细菌感染的药物是抗生素，但是抗生素通过直接抑制病原菌的生长或者以直接杀死病原菌的方法来达到治疗的效果。[2]这种固有的作用机理给予细菌强大的选择压力催生并进一步富集了耐药性菌株，因此细菌的耐药性已经成为日益严峻的全球公共卫生问题。
　　中草药作为我国的优势国药，因其成分复杂，具有对人体毒副作用小，易于代谢等优点，具有广阔应用前景。
　　据报道，许多中草药都具有抗菌性和抗真菌作用，其中鱼腥草、五倍子、金银花、甘草相对于其他中草药材而言，具有来源广泛、价格低廉等特点，故选用这四种中草药进行抑菌性实验，以期从中筛选出抑菌性最好的中草药，为临床研究及应用提供一种参考。[3]
　　1 实验材料
　　1.1 中草药 鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb）、五倍子（Galla Chinensis ）、金银花（honeysuckle）、甘草（glycyrrhiza）
　　1.2 菌种 金黄色 葡萄球菌（Staphyloccocus aureus） 西北民族大学生命科学与工程学院提供。
　　1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基
　　2 实验过程
　　2.1 准备阶段
　　2.1.1 中草药有效成分提取
　　2.1.1.1 鱼腥草（癸酰乙醛）：选取鱼腥草新鲜地下茎，剪成2cm长小段置于磨口锥形瓶中，加入适量乙酸乙酯浸泡456小时（40℃水浴加热）后，采用水蒸气蒸馏法对有效成分进行提取，所得浅黄色精油即为癸酰乙醛粗提取物，保存备用。
　　2.1.1.2 五倍子（没食子酸）：将五倍子洗净、烘干（70℃烘箱中烘烤48h）并粉碎（粉碎样通过60目筛），将粉末置于磨口锥形瓶中，加入适量浓度为15U/g的单宁酶酶制剂，在PH=6的条件下40℃水浴加热4h，最后将提取液置于100℃沸水中加热5min以达到灭酶的目的，所得溶液即为没食子酸粗提取物，保存备用。
　　2.1.1.3 金银花（金银花提取物）：将金银花提前用水润湿，在蒸馏器内安装一个多孔隔板，样品置于隔板上，进行加热蒸馏，所得挥发油即为金银花粗提取物，保存备用。
　　2.1.1.4 甘草（甘草总黄酮）：将甘草洗净、烘干（50℃）并粉碎（粉碎样通过80目筛），利用水提法除去其中的甘草酸，过滤、烘干，置于磨口锥形瓶中，向其中加入适量无水乙醇，在超声功率为250W的超声清洗仪中60℃C提取1h，过滤，所得滤液即为甘草总黄酮粗提取物，保存备用。
　　2.2 试验阶段
　　2.2.1 药敏纸片法
　　2.2.1.1 药敏纸片的制备：将空白药敏纸片在试验前浸泡在各中草药提取液中4-5小时。
　　2.2.1.2 涂板：
　　2.2.1.1.1 培养基的制作 蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，加热至所有药品熔化后，蒸馏水定容至1000ml，琼脂15g，调节pH=7.0～7.2，高温高压蒸汽灭菌30min，待冷却至55℃左右时倒入培养皿。
　　2.2.1.1.2 接菌 待培养皿冷却后，取10-6浓度金黄色葡萄球菌悬液，用无菌微量移液器取10μL菌液，尽快用无菌L型涂菌棒均匀涂布于培养基表面，静置2-3min，将制备好的药敏纸片放置在培养基中央，37°C培养24h。
　　2.2.1.3 测量：用千分尺测量抑菌圈直径，标准为人肉眼可见的无细菌生长的边缘。
　　2.2.2 MIC测定
　　2.2.2.1 药液稀释：将中草药原液分别稀释10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1280倍、2560倍，即最终药液浓度分别为100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.125mg/ml、1.5625mg/ml、0.7825mg/ml、0.39125mg/ml。
　　2.2.2.2 MIC实验 将上述稀释液各取1ml分别置于9支试管中，分别向其中0.1ml菌液（菌液浓度为105cfu/ml），设空白对照管，在恒温培养箱中37℃恒温培养24h。
　　3.结果与讨论
　　3.1 药敏纸片法实验结果
　　表1结果显示，四种中草药均有较好的抑菌效果，其中以五倍子的抑菌效果最为明显，这四种中草药的抑菌性排序为五倍子>金银花>甘草>鱼腥草。
　　3.2 MIC结果
　　3.3 分析与讨论
　　金黄色葡萄球菌作为临床感染主要病原菌之一，不同的中草药对金黄色葡萄球菌的抑菌、杀菌作用、原理不同[4]。由实验结果可得，五倍子、甘草、金银花、鱼腥草这四种中草药对金黄色葡萄球菌抑制作用效果最好的是五倍子，其次为金银花、甘草，最小为鱼腥草。而五倍子的主要成分为鞣酸，鞣酸具有凝固蛋白的作用，能使菌体内的原生质及酶等蛋白质凝固，导致微生物生长代谢受到影响甚至死亡[5]，且五倍子在我国资源分丰富、来源广泛，符合生产生活需求。
　　因此，我们有责任去利用好我国的优势国药，开发出中草药更大的潜在价值，为日后减少抗生素的使用，延长抗生素的使用寿命打下坚实的理论基础。
　　参考文献
　　陈洪升.金黄色葡萄球菌氨基糖苷类、喹諾酮耐药基因的研究[D].广东药学院，2015
　　沈慧玲.关于呼吸内科疾病的抗生素治疗探究[J].医药卫生：文摘版：00119-00119.
　　李军红，田胜尼，方晓光，等.5种常见中草药的抑菌性研究[J].生物技术通报，2006（c00）：395-399.
　　王瑞君.几种中草药对金黄色葡萄球菌体外抑制作用的研究[J].现代食品科技，2009，25（9）：1104-1106.
　　王利，林华忠，刘玉娟，等.4种中草药对金黄色葡萄球菌的抑制作用研究[J].现代农业科技，2012（17）：258-258.

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