降解上部烟叶大分子物质的复合酶配制与条件优化

　　摘要：为降低上部烟叶中淀粉和蛋白质等大分子成分含量，提高其吸食品质，本研究在统一评价酶活力的基础上，选用4种酶制剂（淀粉酶IV.蛋白酶I、果胶酶I和纤维索酶II）配制复合酶制剂，采用单因素法和Box-Benhnken响应面分析法对影响酶解效果的复合酶量、缓冲液pH、含水量和酶解时间等因素进行优化。分析显示，4个因素对上部烟叶中淀粉和蛋白质降解率的影响顺序为：缓冲液pH>酶解时间>含水量>复合酶量。响应面分析结果确定最优酶解条件为：复合酶量1.1单位（即淀粉酶Ⅳ33U/g烟叶，蛋白酶I 550U/g烟叶，果胶酶1220U/g烟叶，纤维索酶II220U/g烟叶）、缓冲液pH 7.7、含水量54%、酶解时间5.5 h，此时淀粉和蛋白质降解率分别为19.54%和20.03%。本研究中的复合酶制剂及酶解条件可以很好地结合于烟草打叶复烤工艺过程中，具有较好的应用前景。
　　关键词：复合酶：上部烟叶：淀粉：蛋白质：响应面法
　　烤烟的上部烟叶包括上二棚叶和顶叶，共6～7片，占整株烟叶总产量的30%-40%。上部烟叶叶片较厚，组织结构较紧密，淀粉、蛋白质等大分子成分含量过高，燃烧后具有烟气浓度和劲头大、刺激性大、杂气重等缺点，工业可用性较差。
　　近年来的研究中，改善上部烟叶吸食品质的方法主要有3种：生物酶法、化学添加法、微生物发酵法。其中，生物酶法因为条件温和、易于操作、改善效果明显，在实际应用中具有一定优势。外加复合酶在较温和的条件下，将淀粉、蛋白质以及果胶、纤维素（细胞壁物质）等大分子物质分解成低聚糖、半乳糖醛酸、还原糖、短肽和氨基酸等以减少烟草原料的刺激性和杂气，改善吸食品质，提高其在烟草行业中的使用价值。然而，由于不同来源的市售酶制剂酶活单位定义不同，无法比较不同来源酶制剂的作用效果，导致实验得出的酶制剂使用量和配方无法重现。因此，虽然已有较多酶法改善上部烟叶品质的研究，但实际应用较少。
　　本研究选择4类生物酶（淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和纤维素酶），在对其进行统一酶活评价的基础上，以淀粉降解率和蛋白质降解率為评价指标，采用单因素法和响应面法对复合酶量、酶解条件进行优化，以缩短酶解时间，与现代烟草加工工艺相协调，使上部烟叶中淀粉和蛋白质的含量降低，同时增加水溶性糖分及氨基酸，使上部烟叶中各化学成分比例相对协调，从而改善上部烟叶的杂气、劲头和刺激性，为提高上部烟叶品质奠定理论基础。
　　1材料与方法
　　1.1试验材料
　　上部烟叶B2F：上海烟草集团有限责任公司提供，2014年产于贵州，烟叶经切丝后用于酶解。盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、浓硫酸等，AR：酪蛋白、果胶、淀粉：半乳糖醛酸标品。以上试剂均由中国国药集团化学有限公司生产。
　　淀粉酶I，中温淀粉酶BAN 0.8L（诺维信Novozymes生物技术有限公司）：淀粉酶II，高温淀粉酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）：淀粉酶III，高温淀粉酶（上海麦克林生化科技有限公司）：淀粉酶IV，低温淀粉酶（江苏锐阳生物科技有限公司）。蛋白酶I，中性蛋白酶0.8 L（诺维信Novozymes生物技术有限公司）：蛋白酶II，水解蛋白酶2.4 L（诺维信Novozymes生物技术有限公司）：蛋白酶III，中性蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）。果胶酶I，上海源叶生物科技有限公司：果胶酶II，江苏锐阳生物科技有限公司。纤维素酶I，上海麦克林生化科技有限公司：纤维素酶II，江苏锐阳生物科技有限公司。
　　1.2仪器与设备
　　H2-2型电热恒温振荡水浴箱，上海精宏实验设备有限公司：TGL-16M型台式高速离心机，湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司：Enspire 2300多标记检测系统（酶标仪），美国PerkinElmer公司UV3000型紫外一可见光分光光度计，日本Himchi公司：MB45红外水分测定仪，美国OHAUS仪器有限公司：FA1004型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司：SKD-200凯氏定氮仪，上海沛欧分析仪器有限公司；SKD-0892红外智能消化炉，上海沛欧分析仪器有限公司。
　　1.3测定方法
　　1.3.1原料预处理
　　陈化后的上部烟叶经松散回潮、切丝、烘丝后，制得试验用长度均匀的烟丝（水分约12.5%，以红外水分测定仪测得）。
　　1.3.2烟丝的酶解精确称取（25.00±0.02）g烟丝置于筛网，于65℃水浴箱中保温回潮20 min，使烟丝水分含量约21%。将回潮结束的烟丝平铺于干净的20 cmx16 cm陶瓷托盘，按照一定料水比将酶液（pH 7.5磷酸缓冲液溶解并稀释）均匀喷洒在烟丝上，喷洒过程中常翻动烟丝使酶液混合均匀，以食品级密封袋密封好，于适当温度恒温箱中酶解。酶解结束后，采用烘箱快速烘干至水分含量12.0%-12.5%，待测。
　　1.3.3复合酶制剂配方中酶种类的选择在30～70℃范围内测试各种酶的活性变化，初步确定适合于多种酶类进行反应的温度，以及在此温度下活性较高的商品酶（淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和纤维素酶各1种）作为酶制剂的配方用酶，同时对酶的活性进行统一评价。根据所确定的酶解温度和酶种类，将1mL一定浓度的淀粉酶、果胶酶、纤维素酶分别与蛋白酶混合，在40℃下反应30 min，迅速将混合体系置于冷水中冷却，再测定各种酶的活性。以不添加蛋白酶的体系为对照，确定蛋白酶对其他酶活性的影响。
　　1.3.4单位复合酶制剂中各种酶添加量的确定以不同浓度的淀粉酶（2、5、10、30、50 U/g烟叶）、蛋白酶（100、250、500、1000、2000 U/g烟叶）、果胶酶（50、100、200、500、1000 U/g烟叶）、纤维索酶（50、100、150、200、300 U/g烟叶）分别以料水比20：1加料于烟丝，密封后于40℃恒温酶解30 min，按1.3.2所述烘干至水分含量12.0%-12.5%，测定各样品中相应成分含量，根据结果确定单位复合酶中各种酶的添加量。

相关热词搜索：大分子 降解 烟叶 配制 复合