虾肝肠胞虫LAMP检测方法的建立

　　摘 要 为建立一种快速检测虾肝肠胞虫（EHP）的环介导等温扩增方法（LAMP），根据GenBank中登录的EHP-SSU基因序列设计了6条LAMP特异性引物，经反应体系和反应条件的优化，建立了EHP-LAMP检测方法。该方法的检出限为3.71个质粒拷贝/μL；与对虾其他常见病毒病的病原（WSSV、IHHNV、CMNV）均无交叉反应。使用LAMP方法和普通PCR方法对30份具有典型EHP感染症状的对虾样品进行检测，结果显示：LAMP和PCR方法的阳性检出率均为100%。表明建立的EHP-LAMP方法具有高灵敏度、高特异性、高准确度的优点，适用于生产中对虾肝肠胞虫的快速早期诊断，为EHP的防治提供技术支撑。
　　关键词 对虾；肝肠胞虫；环介导等温扩增；检测
　　中图分类号：S945.4 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.09.058
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料和仪器设备
　　采自天津市东丽区华明街胡张庄村的南美白对虾样品，具有典型的EHP感染症状，经PCR检测并测序后确认为EHP感染，由本实验室保存；经检测未感染EHP的对虾基因组、仅感染对虾白斑病毒（WSSV）的对虾基因组、仅感染对虾皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的对虾基因组、仅感染偷死野田村病毒（CMNV）的对虾RNA均由本单位病原检测室提供；海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（天根生物）；10 mM dNTP、质粒提取试剂盒均购自大连宝生物（TakaRa）；Bst DNA聚合酶（NEB）、钙黄绿素染料（北京蓝谱）、甜菜碱（Sigma）。PCR仪（ABI）、凝胶成像系统（Biometra）、金属浴（天根生物）、离心机（Sigma）、电泳仪（北京六一）[1]。
　　1.2 方法
　　1.2.1 LAMP引物设计与合成
　　根据GenBank发布的EHP基因序列及相关文献资料，选取EHP-SSU（登录号：FJ496356.1）为靶基因，按照LAMP引物设计原则，使用在线设计软件Primer Explorer version 5 （http：//primerexplorer.jp/e）设计6条引物，分别为外引物F3/B3，内引物FIP/BIP和环引物LF/LB，引物由上海生工合成[2]。
　　1.2.2 LAMP反应条件优化
　　按照海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取感染EHP对虾的基因组DNA，作为LAMP扩增反应的模板。EHP-LAMP的基础反应体系（25μL）：2.5μL 10×Bst DNA聚合酶buffer，3.5μL 10 mM dNTP，1.5μL 100 mM MgSO4，0.4μL 100 μM FIP，0.4 μL 100 μM BIP，0.2μL 100 μM LF，0.2μL 100μM LB，0.05μL 100 μM F3，0.05μL 100μM B3，8 U Bst DNA聚合酶，1μL钙黄绿素染料，3μL 5 M甜菜碱，灭菌水适量，2μL模板。基础反应条件为63 ℃ 60 min，80 ℃ 10 min。为了得到最佳扩增效果，在基础反应体系上对其可能影响较大的试剂，如甜菜碱、dNTP、MgSO4、Bst DNA聚合酶等的用量以及反应条件进行优化。
　　1.2.3 LAMP反应体系的灵敏度试验
　　将用于EHP-LAMP引物设计的SSU基因序列与pUC57载体连接，构建SSU-pUC57质粒，质粒构建工作由上海生工完成。利用质粒提取试剂盒提取SSU-pUC57质粒，利用核酸检测仪测定所提取质粒的初始浓度，根据公式：质粒拷贝数/μL=质粒浓度（g/μL）/质粒分子量×阿佛加德罗常数，计算出SSU-pUC57质粒拷贝数为3.71×109，用灭菌水按10倍递进稀释法将质粒稀释至3.71个质粒拷贝/μL，取2μL各浓度稀释液分别进行LAMP和PCR扩增（以F3/B3为上下游引物进行PCR扩增，产物大小为191 bp），比较两种方法的最低检测量。
　　1.2.4 LAMP反应体系的特异性试验
　　將天津市水生动物疫病预防控制中心病原检测室提供的仅感染WSSV的对虾基因组、仅感染IHHNV的对虾基因组、仅感染CMNV的对虾RNA（反转录成cDNA后作为模板）以及感染EHP的对虾基因组，同时设阴性对照和阳性对照（SSU-pUC57质粒），按照上述建立的LAMP方法进行EHP-LAMP检测体系的特异性分析。
　　1.2.5 临床样品的检测
　　同时利用本研究建立的EHP-LAMP检测技术和PCR方法，分别对挑选30尾具有典型感染EHP症状的对虾进行检测，并将这两种方法得到的结果进行比较。
　　2 结果
　　2.1 EHP-LAMP的优化结果
　　经试验结果综合分析，发现甜菜碱、MgSO4和dNTP的加入量对EHP-LAMP反应体系的扩增效率影响较大。最终确定EHP-LAMP的最佳反应体系为：2.5 μL 10×Bst DNA聚合酶buffer，2.5 μL 10 mM dNTP，2 μL 100 mM MgSO4，0.4 μL 100 μM FIP，0.4 μL 100 μM BIP，
　　0.2 μL 100 μM LF，0.2 μL 100 μM LB，0.05 μL 100μM F3，0.05 μL 100μM B3，8 U Bst DNA聚合酶，1 μL钙黄绿素染料，1 μL 5M甜菜碱，2 μL模板灭菌水定容总体积至25 μL。反应条件为63 ℃ 40 min，80 ℃ 5 min。
　　2.2 灵敏度试验结果
　　利用优化条件后的EHP-LAMP和PCR检测方法对不同稀释倍数的模板进行扩增，结果显示：LAMP检测方法的检出限为3.71个质粒拷贝/μL，PCR检测方法的检出限为371个质粒拷贝/μL，LAMP检测方法的灵敏度高于PCR。

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