茶叶生产废料中表没食子儿茶素没食子酸酯的纯化工艺

　　摘要：分析了茶叶生产废料中表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的纯化工艺，并采用大孔树脂对其进行分离纯化。结果表明，运用静态吸附与动态吸附相结合的方法分析得到，适用于茶叶生产废料中EGCG分离纯化用的大孔吸附树脂为D101。其最佳分离纯化条件为：将20.0 mg/mL上柱液以1.5 BV/h上柱4.5 BV，使用20%乙醇以0.5 BV/h洗脱4.0 BV。
　　关键词：茶叶生产废料；表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）；纯化
　　中图分类号：S571.1；TS272.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4570-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.045
　　茶叶是恩施土家族苗族自治州的六大经济支柱产业之一，在其生产过程中会产生大量的废料——茶梗、茶末、茶树修剪枝条等。这些废料因含有表没食子儿茶素没食子酸酯（以下简称EGCG）而极具开发价值[1]。据文献报道，EGCG具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗氧化、免疫调节、对糖尿病肾脏的保护、防辐射等作用，还可以降压、降脂、降血糖[2-7]。为了综合开发茶叶资源，促进恩施州茶叶产业链的有效延伸，增加当地茶农的收入，采用当地产量大、价格低廉的茶叶生产废料提取EGCG，并对其提取工艺进行研究，以期更有效地开发利用茶叶废料。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　茶叶生产废料购于恩施市清江生物有限公司。大孔树脂：D608、 HPD100、 XDA-1、 D302、 D101B、D609、D103、D102、D4020、DM130、D101、D301、X-5及聚酰胺型树脂（上海摩速科学器材有限公司）。
　　EGCG标准品（批号：100603，含量≥98%，上海融禾医药科技有限公司提供）；水为纯化水；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。
　　1.2 仪器
　　DIONEX U3000 高效液相色谱仪（Chromeleon色谱工作站），Acclaim 120 C18 5 μm Analytical （4.6 mm×250 mm）色谱柱，VWD3100检测器； MS105 半微量天平（感量0.01 mg，METTLER TOLEDO）；AL204 分析天平（感量0.1 mg，METTLER TOLEDO）；LGJ-10冻干机（北京四环科学仪器厂）；KQ-2500超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，33 kHz）；UV2600紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；微孔滤膜（有机系，0.22 μm）。
　　1.3 方法
　　1.3.1 标准曲线绘制 精密称取EGCG标准品适量，置于棕色量瓶中，加甲醇溶解制成浓度为0.3 mg/mL的溶液，摇匀，微孔滤膜过滤，取滤液作为标准品溶液。取5、10、15、20、25 μL标准品溶液参照文献[8]的色谱条件分别测定峰面积，平行测定3次。以进样量X（μg）为横坐标轴、峰面积A为纵坐标轴绘制标准曲线，计算其线性回归方程。
　　1.3.2 EGCG测定方法 称取茶叶生产废料细粉0.2 g，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇超声提取30 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，取滤液测定峰面积并带入回归方程计算茶叶生产废料中EGCG的含量。
　　1.3.3 EGCG提取方法 取茶叶生产废料粗粉10 g置于索氏提取器中，参照文献[9]的方法提取2次，趁热抽滤，合并滤液，减压浓缩至无乙醇味，得茶叶生产废料提取液。
　　1.3.4 EGCG纯化工艺
　　1）树脂的筛选。对大孔树脂进行预处理[10，11]，分别量取预处理好的大孔树脂10 mL，置250 mL具塞锥形瓶中，加入100 mL已知EGCG浓度的茶叶生产废料提取液，25 ℃、100 r/min振荡24 h后取出，测定EGCG吸附量，并计算比吸附量（比吸附量=EGCG吸附量/树脂体积）；静态吸附完成后，过滤除去茶叶生产废料提取液，将树脂重新置于250 mL具塞锥形瓶中，加入100 mL 95%乙醇以25 ℃、100 r/min振荡24 h取出，测定EGCG解吸量，计算解析率（解析率=被解析EGCG量/被吸附EGCG量×100%）。选择比吸附量大且解析率高的大孔树脂作为分离纯化EGCG的树脂。
　　2）吸附条件优化。改变样品的浓度、上样速度对吸附条件进行优化[10，11]。分别取60 mL筛选出的树脂装入3根玻璃柱，充分沉降均匀，将样品溶液以一定速度通过树脂柱，前150 mL流出液不收集，后每15 mL收集1份，分别取5 μL测定EGCG峰面积，绘制曲线图，确定上样浓度及上样速度。根据确定的上样浓度和上样速度进行动态吸附，并测定EGCG峰面积，绘制泄露曲线。
　　3）洗脱条件优化。改变乙醇的体积分数、洗脱流速对洗脱条件进行优化[10，11]。按上述确定的吸附条件上柱，吸附平衡后，用2 BV纯化水淋洗树脂柱，后依次用不同体积分数的乙醇溶液以不同的流速淋洗树脂柱，各浓度淋洗液的量为3 BV。收集淋洗液，每15 mL收集1份，每份淋洗液取5 μL进行液相色谱仪分析，测定EGCG峰面积，绘制洗脱曲线，考察乙醇体积分数、洗脱流速对洗脱效果的影响。
　　2 结果与分析
　　2.1 标准曲线
　　线性回归方程为：A=22.733X-0.5571，r=0.999 8（n=5）。
　　2.2 含量测定
　　采用HPLC分析得到茶叶生产废料中EGCG的含量为82.42 mg/g。
　　2.3 树脂的筛选
　　在筛选的14种树脂中，多种大孔树脂对茶叶生产废料中EGCG的比吸附量都较大，但以D101型树脂为好，从解析率来看，也以D101型树脂为最好，故确定D101型树脂为分离纯化茶叶生产废料提取液中EGCG的最佳树脂。

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