黑老虎烟叶浸膏生物酶法制备工艺及品质评价

　　摘 要：以广昌晒红烟“黑老虎”烟叶为原料，采用生物酶法水解黑老虎烟叶，结合现代膜分离提取与旋转蒸发浓缩技术，制备黑老虎烟叶浸膏。探讨了膜分离技术在浸膏制备中的应用，以10～20 kD膜过滤制备的浸膏为最优；理化性质分析和GC-MS检测表明生物酶法制备的黑老虎浸膏样品具有较高的质量稳定性和制备工艺稳定性；叶组和卷烟评吸结果及GC-MS检测结果显示添加黑老虎浸膏后卷烟风格特征在干草香、甜香、烘焙香、可可香、辛香、膏香方面提升明显，并且生物法制备的浸膏的提升效果优于水煮法和酒精萃取法。
　　关键词：黑老虎 烟叶浸膏 GC-MS 膜分离 致香成分
　　中图分类号：R19 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2014）02（c）-0081-02
　　1 材料与方法
　　1.1 材料、试剂与仪器
　　1.1.1 材料
　　广昌晒红烟“黑老虎”烟叶（由江西中烟工业有限责任公司提供）。
　　1.1.2 试剂
　　诺维信公司的复合纤维素水解酶、果胶酶和蛋白酶；北京普博欣公司的葡萄糖测定试剂盒、氢氧化钠和柠檬酸等分析纯试剂。
　　1.1.3 主要仪器
　　Eppenclorf离心机Centrifuge-5418（艾本德中国有限公司）；J1200型电子天平（双杰测试仪器厂）；HH S- 3型恒温水浴锅（巩义市矛华仪器有限公司）；PB-10型pH计（赛多利斯公司）；LD-100型试样粉碎机（红太阳机电有限公司）；PT-3502型酶标仪（普天新桥技术有限公司）；KM-3型高效超滤膜分离设备（广州洁圣膜技术有限公司）；旋转蒸发仪RE-5250（郑州宏朗仪器设备有限公司）；GC-MS安捷伦气质联用6890-5973（安捷伦科技有限公司）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 生物酶法水解黑老虎烟叶提取致香成分
　　取10 g黑老虎烟叶，去梗、切丝，粉碎至60～80目，加8倍体积无菌水浸泡1 h，85 ℃水浴灭菌5 min，冷却，调节pH至5.0，加入1.75%（w/w）复合纤维素水解酶、1.5%（w/w）果胶酶PECTINEX，在50 ℃、pH5.0条件下进行水解反应2 h。80 ℃水浴10 min将酶灭活，调节pH至5.0，冷却后加入1.5%（w/w）蛋白酶Flavourzyme，在50 ℃、pH5.0条件下进行水解反应2 h。80 ℃水浴10 min将酶灭活，所得样品用200目滤布过滤除去残渣，得上清液即为烟叶提取物。
　　1.2.2 超滤膜浓缩黑老虎烟叶水解液，旋转蒸发制备黑老虎烟叶浸膏
　　取黑老虎烟叶水解液，经甩干式离心机粗过滤，自然沉淀16 h，取上清液抽滤，滤液经冷冻离心机离心（10000 rpm，5 min）进一步去除不溶性成分，取上清液进行超滤膜分离。利用旋转蒸发仪浓缩黑老虎烟叶水解液至原体积的1/6，得到黑老虎烟叶浸膏。
　　2 结果与讨论
　　2.1 不同分子量超滤膜分离样品的致香成分分析和卷烟评吸分析
　　表1的评吸结果显示膜过滤后的浸膏产品在苦味、甜味、舒适感方面都有所提升。但是经膜过滤会造成大量的致香物质流失，在烟气特征、香气风格方面明显不如未经膜过滤的浸膏。综合考虑，以10～20 kD膜过滤制备的浸膏为最优选择。
　　2.2 黑老虎烟叶浸膏制备工艺稳定性和产品质量稳定性
　　2.2.1 工艺稳定性研究
　　对三个批次的黑老虎烟叶浸膏样品的理化性质（折光值、密度、糖度）进行分析，结果表明不同批次的黑老虎浸膏样品在折光值、密度、糖度方面保持了较好的稳定性（图1A）。同时，GC-MS分析共检测到75种致香成分，不同批次黑老虎浸膏样品在致香成分种类、数目、含量方面保持稳定（图1B）。
　　2.2.2 质量稳定性研究
　　将浸膏样品在放置30天、45天、60天、75天、90天、105天后检测其理化性质，浸膏样品的折光值、密度、糖度未发生明显变化（图2A），GC-MS分析表明其致香成分含量也保持较高的稳定性（图2B）。
　　2.3 生物酶法制备工艺的先进性
　　将水煮法、酒精萃取法、生物酶法制备的黑老虎烟叶浸膏添加到叶组、卷烟中。结果显示添加黑老虎烟叶浸膏后卷烟风格特征在木香、坚果香、干草香、膏香等方面提升明显，在烟气特征方面丰富度、烟气浓度、劲头方面均有提升，并且生物法制备的浸膏的提升效果优于水煮法和酒精萃取法。通过GC-MS技术对各样品的致香成分进行定量分析[1]，结果表明生物法制备的黑老虎浸膏的致香成分含量远远高于水煮法和酒精萃取法。
　　3 结论
　　本研究旨在利用生物酶法制备黑老虎烟叶浸膏，尽量保留其致香成分，将其添加到叶组配方中，在烤烟型卷烟降低焦油后香气略显不足的情况下[2]，大幅度提升低焦油卷烟香气。本研究的开展，从技术层面支撑广昌“黑老虎”烟叶的深度挖掘与应用，有利于烟草提取工艺的技术革新，为低焦油卷烟设计与产品风格固化提供强有力的技术支持[3～4]，具有较好的社会效益和经济效益。（1）优化了利用旋转蒸发技术制备黑老虎烟叶浸膏的工艺流程，探讨了膜分离技术在浸膏制备中的应用，膜分离技术可以有效去除浸膏中的杂质，提升黑老虎烟叶浸膏品质，以10～20 kD膜过滤制备的浸膏为最优选择。（2）理化性质分析和GC-MS检测表明生物酶法制备的黑老虎浸膏样品具有较高的质量稳定性和制备工艺稳定性。（3）对黑老虎烟叶的质量风格特色、生物法提取样品的致香成分进行分析，并与其他制备工艺做了详细的对比。将水煮法、酒精萃取法、生物法制备的黑老虎烟叶提取物添加到叶组、卷烟中，评吸结果显示添加黑老虎浸膏后卷烟风格特征在干草香、甜香、烘焙香、可可香、辛香、膏香方面提升明显，并且生物法制备的浸膏的提升效果优于水煮法和酒精萃取法。通过GC-MS技术对各样品中的致香成分进行定量分析，结果表明生物法制备的黑老虎浸膏的致香成分含量远远高于水煮法和酒精萃取法。
　　参考文献
　　[1] 李炎强，申进朝，刘克建，等.GC/MS技术分析烟草挥发性、半挥发性酸性成分[J].分析化学，2004，32（5）：694.
　　[2] 周四毛，彭桂新，于建春.降低卷烟焦油量的技术措施研究[J].烟草科技，1997（125）：8-9.
　　[3] 赵瑞花，王菊，张江宏，等.卷烟添加剂的应用和安全性研究进展[J].山西化工，2010，30（6）：14-17.
　　[4] 袁球，李琰琰，周治宝，等.不同肥料品种对广昌“黑老虎”晒烟产量质量的影响[J].生物灾害科学，2013，36（2）：227-231.

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