掺杂玉米茶叶的基因组DNA提取与PCR检测方法建立

　　摘要：根据玉米内源ZEIN基因建立了茶叶中掺杂玉米的普通PCR和实时荧光PCR检测方法。结果表明，标准CTAB法适合提取茶叶样品基因组DNA，实时荧光PCR的灵敏度能达到0.1%，普通PCR能达到1%，实时荧光PCR是普通PCR的10倍。两种方法都能达到检测要求。
　　关键词：茶叶（Camellia sinensis）；玉米（Zea mays）；普通PCR；实时荧光PCR；检测方法
　　中图分类号：Q78；S571.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5615-03
　　目前，我国的茶叶（Camellia sinensis）年消费量已高达66万t，人均饮茶量0.45 kg/年。茶对我国的社会历史文化和现实生活都产生了重要影响[1]。茶叶质量安全主要包括茶叶掺假、农药残留、重金属污染、有害微生物污染、磁性物和粉尘污染等因素[2，3]。其中茶叶中掺假的问题近年来越发严重，一些不法商贩为了获取高额利润在茶叶中掺杂各种谷类物质，以次充好，以假冒真。茶叶掺假的方式有：以类似茶叶的其他植物叶冒充茶叶；在真茶叶中掺入假、次茶叶；晒干饮用过的茶叶重新销售等[4]。此外，茶叶中还出现了掺淀粉、甘薯粉、面粉或其他谷类淀粉加水、加热促成淀粉糊，于茶叶初制或再加工过程中加入，其目的或是将末茶重新造形，促成条状；或是将粗老茶特别是回笼茶（泡过的茶叶）揉成条，并增进重实感；或是利用淀粉糊的黏性，掺入一些沙土、木灰、煤屑等以增重；或上述掺伪兼而有之[5]。
　　PCR技术具有快速、灵敏、特异性高的特点[6]，已广泛应用于食品、饲料中外源成分的检测。本研究根据玉米（Zea mays）内源ZEIN基因建立了茶叶中掺杂玉米的普通PCR和实时荧光PCR检测方法，以期能够快速、准确地检测出茶叶中掺杂的玉米。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与仪器
　　茶叶和玉米购自宁波市欧尚超市散装商品（样品在小型食品加工机中充分加工成细粉）。Taq DNA聚合酶和dNTPs等PCR试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
　　1.2 基因组DNA的提取
　　称取含有10%玉米的茶叶样品200 mg和纯玉米样品20 mg分别采用标准CTAB法[7]、改良CTAB法[8]和试剂盒法提取两种样品基因组DNA，用U-0080D型生物分光光度计测定基因组DNA浓度。
　　1.3 不同浓度梯度玉米的茶叶样品基因组DNA的提取
　　将玉米样品掺入到茶叶中，分别配制成浓度为10.0%、3.0%、1.0%和0.1%的茶叶样品，并利用标准CTAB法提取基因组DNA，用U-0080D型生物分光光度计测定基因组DNA浓度。
　　1.4 PCR 扩增
　　1）实时荧光PCR扩增[9]。实时荧光PCR扩增体系参照One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit说明。20 μL反应体系为：20 μmol/L 上、下游引物各0.4 μL、20 μmol/L荧光探针0.8 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、2×TaKaRa Premix Ex Taq 10.0 μL、Rnase-free water 4.0 μL，DNA模板4.0 μL。每样品设一个平行反应，并设置阴性对照与空白对照。反应程序为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40个循环。
　　2）普通PCR扩增[10，11]。普通PCR反应体系为：20 μmol/L上、下游引物各0.4 μL、Rnase-free water 5.2 μL、2×Taq Mastermix 10.0 μL，最后加入4.0 μL DNA模板，总体积20 μL。每样品设一个平行反应，并设置阴性对照与空白对照。反应程序为：94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，40个循环；72 ℃延伸7 min。
　　实时荧光PCR扩增结束后在ABI Prism 7000中观察并记录结果；普通PCR扩增反应结束后，PCR扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在GelDoc-EQ（Bio-Rad）凝胶成像系统上观察并记录结果。
　　2 结果与分析
　　2.1 3种方法提取含10.0%玉米的茶叶样品基因组DNA浓度和纯度
　　由表1可知，试剂盒法提取的基因组DNA浓度较低，纯度与另外两种方法相差不大，改良CTAB法提取的基因组DNA的浓度和纯度比标准CTAB法提取的基因组DNA的浓度和纯度都要高，但相差不大。
　　2.2 茶叶样品普通PCR和实时荧光PCR扩增结果
　　3种提取方式都有清晰而明显的扩增条带，其中标准CTAB法得到的基因组DNA扩增条带最亮（图1A）。标准CTAB法和改良CTAB法提取得到的基因组DNA都有明显的扩增曲线（图1B）。结合DNA浓度检测结果，3种方法提取到的基因组DNA纯度相近，但标准CTAB法和改良CTAB法提取得到的基因组DNA浓度更高。而标准CTAB法更加简洁，所用时间更短，因此确定了最适合的提取方法为标准CTAB法。
　　含1.0%、3.0%和10.0%玉米的茶叶样品DNA有扩增条带，而含0.1%玉米的基因组DNA没有扩增条带（图2A），因此普通PCR能达到的检测灵敏度为1.0%。含0.1%、1.0%、3.0%和10.0%玉米的基因组DNA都有显著扩增曲线（图2B），因此实时荧光PCR的灵敏度能达到0.1%，是普通PCR的10倍。
　　3 小结与讨论
　　本研究以建立茶叶中掺杂玉米成分的普通PCR和实时荧光PCR两种检测方法为目标，优化了核酸提取的方法。结果表明，标准CTAB法提取的DNA纯度和得率都较高；改良CTAB法提取的DNA纯度和得率也都较高，与标准CTAB法提取的DNA纯度和得率差异不大，但是其耗费时间更长，所用试剂更多；试剂盒法提取的DNA虽然纯度和其他两种方法的差异不大，所用时间更短，但是其得率不高且成本较高。因此确定了标准CTAB法为最适合的核酸提取方法。实时荧光PCR方法检测茶叶中掺杂玉米成分的优点在于：①对玉米目的基因进行扩增后，不再需要凝胶电泳检测，缩短了检测时间，且不再需要接触到EB；②准确性很高，不容易出现假阳性，特异性更强[12]。实时荧光PCR的灵敏度能达到0.1%，普通PCR能达到1.0%，实时荧光PCR是普通PCR的10倍。

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