神经网络结合灰色关联度法对气滞胃痛颗粒复方药材抗炎活性谱效关系研究

　　[摘要] 目的：建立气滞胃痛颗粒抗炎活性的谱效关系分析方法，为中药复方的质量控制和药效评价奠定基础。方法：在建立气滞胃痛颗粒全时段多波长融合指纹图谱分析方法的基础上，采用拉丁超立方法对气滞胃痛颗粒中6味药材随机采样成不同比例组，测定各组对LPS诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α，IL-6，NO的抑制率，将药效信息与各组HPLC指纹图谱化学信息用灰色关联度分析得出各色谱峰对抗炎活性的影响程度，再用BP神经网络进行拟合，建立谱效关系。结果：有25个色谱峰与抗炎活性密切相关，采用3层BP神经网络，以这25个色谱峰量化峰面积作为输入项，建立了气滞胃痛颗粒抗炎药效的神经网络模型。结论：该模型预测误差小于7%，能较好的拟合复方中复杂的非线性关系，可以应用于复方中药谱效关系研究。通过谱效研究建立了评价气滞胃痛颗粒抗炎活性的新方法，是中药复方质量控制和寻找药效物质基础的有效途径，具有一定实际意义。
　　[关键词]气滞胃痛颗粒；抗炎；谱效关系；神经网络；灰色关联度法
　　[稿件编号] 20121025006
　　[基金项目] 国家自然科学基金项目（81241111）；国家“重大新药创制”科技重大专项（2010ZX09401-304-201）
　　[通信作者] *孟宪生，Tel：（0411）87406496，E-mail： mxsvvv@126.com
　　[作者简介] 许雯雯，硕士研究生，Tel：（0411）87406496，E-mail：xww159@sina.com
　　气滞胃痛颗粒为《中国药典》收载的非处方中成药，由柴胡、延胡索（炙）、枳壳、香附（炙）、白芍、炙甘草6味药材组成，有舒肝理气，和胃止痛之效^[1]，临床上可用于治疗肝郁气滞，胸痞胀满，胃脘疼痛等症，具有抗炎镇痛、抗溃疡、促胃动力3个主要作用^[2-3]。《中国药典》2010年版一部主要采用高效液相色谱法测定芍药苷含量。中药复方化学指纹图谱对化学成分定性定量起到质量控制的作用，但不能全面反映中药复方的真实药效。本实验将气滞胃痛颗粒中6味道地药材通过拉丁超立方法^[4]随机采样成不同比例组后提取，进行体外抗炎活性的实验研究，采用综合评分法^[5]对3个考察指标做了进一步数学处理，使之更加科学化，将药效学信息与各组HPLC指纹图谱的化学信息用灰色关联度分析^[6]软件进行相关性分析，得出与抗炎活性密切相关的化学成分，并运用BP神经网络建立了抗炎活性的预测模型，以便更好地评价气滞胃痛颗粒抗炎的真实药效。
　　1 材料
　　1.1 仪器与设备 Agilent-1100高效液相色谱仪（Agilent 1100泵、Agilent 1100光电二级阵列检测器、Agilent 1100色谱工作站，美国安捷伦科技公司）；Sartorius CP225D电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；NUAIRETM US AUTOFLOW型CO₂培养箱（德国NUAIRE公司）；AE31型倒置相差显微镜（德国Motic公司）；SUNRISE酶标仪（瑞士TECAN公司）；血球计数板（上海求精生化仪器厂）；96孔无菌培养板（美国Costar公司）。
　　1.2 药材与试剂 柴胡、延胡索、白芍、甘草、香附、枳壳药材均由辽宁本溪三药有限公司提供，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定，分别为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根、罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎、毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎、莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根茎、芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实；气滞胃痛颗粒（辽宁本溪三药有限公司，批号20111123）；对乙酰氨基酚对照品（批号018-8905，中国食品药品检定研究院）；乙腈（色谱纯，TEDIA公司）；甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）； DMEM培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（美国GIBCO公司）；小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒、小鼠一氧化氮（NO）试剂盒、小鼠白细胞介素-6（IL-6）试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）。
　　1.3 细胞株 小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。
　　1.4 动物 健康SD大鼠，体重（200±20） g，雌性，由大连医科大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（辽）2011-0002。
　　2 方法与结果
　　2.1 供试样品的制备 拉丁超立方采样（LHS）属于分层采样，是一种有效地用采样值反映随机变量的整体分布方法，其目的是要保证所有的采样区域都能够被采样点覆盖^[7]。使用Isight软件对各药材量进行拉丁超立方采样，柴胡、甘草、延胡索、枳壳、香附均按0～10 g，白芍按0～15 g抽样，进行20次实验，结果见表1。
　　表1 拉丁超立方随机抽样结果
　　Table 1 Results of LHSg
　　将20组药材分别混匀，置圆底烧瓶中，20倍量水回流提取2 h，摇匀，滤过，挥干，均定容到250 mL量瓶中，取药液用95%乙醇沉至醇浓度为90%，静置24 h，滤过，挥干，均定容到250 mL量瓶中，取2 mL供试品溶液，加入对乙酰氨基酚对照品200 μL（0.229 9 g·L^-1）作为内标液，再用直径为0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，置于4 ℃保存待用。其余供试品溶液置水浴锅中挥干后计算出膏率，备用，留做药效实验。

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