蟾蜍类药材中吲哚生物碱和蟾毒配基类成分的含量

　　[摘要]目的：建立蟾蜍类药材中吲哚生物碱和蟾毒配基类成分的HPLC含量测定法，并对蟾酥、蟾皮、蟾衣中2类成分进行分析。方法：吲哚生物碱类，Nucleosil C18柱，乙腈-0.5%磷酸二氢钾溶液（6∶94，磷酸调pH 3.2）为流动相，流速0.8 mL·min^-1，检测波长275 nm，柱温30 ℃；蟾毒配基类，Alltima C18柱，乙腈（A）-0.3%乙酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～15 min，28%～54%A；15～35 min，54%A），流速0.6 mL·min^-1，检测波长296 nm，柱温30 ℃。结果：五羟色胺、N-甲基五羟色胺、N，N-二甲基五羟色胺、N，N，N-三甲基五羟色胺、蟾蜍噻咛依次在0.079 6～0.796，0.097 2～1.945，0.074 4～0.744，0.103～2.05，0.067 2～0.672 μg线性关系良好；五羟色胺和N-甲基五羟色胺的平均加样回收率依次为98.6 %和91.3 %；日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基依次在0.004 83～0.614，0.007 9～1.006，0.007 95～1.016，0.009 7～1.24，0.009 6～1.22 μg线性关系良好；平均加样回收率依次为101.6%，102.5%，101.0%，99.1%，98.9%。结论：蟾酥中吲哚生物碱和蟾毒配基类成分含量均较高，蟾皮中含量次之，蟾衣中含量最低甚至检测不到。
　　[关键词]蟾酥；蟾皮；蟾衣；吲哚生物碱；蟾毒配基；HPLC
　　蟾酥、蟾皮（干蟾）和蟾衣分别来源于蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍B. melanostictus Schneider皮肤腺和耳后腺干燥分泌物、除去内脏的干燥表皮（全体）和自然褪下的角质衣膜。蟾蜍类中药材中化学成分主要包括吲哚生物碱和蟾毒配基2类，目前已从中分离得到蟾毒配基类化合物103个，吲哚生物碱类12个[1]；关于该类药材的质量分析多集中于蟾毒配基类成分，关于吲哚生物碱类成分的含量测定较少[2-3]。本实验建立了蟾蜍类药材中5种吲哚生物碱（五羟色胺、N-甲基五羟色胺、N，N-二甲基五羟色胺、N，N，N-三甲基五羟色胺、蟾蜍噻咛）和5种蟾毒配基类化合物（日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基）的HPLC测定法，比较了蟾酥、蟾皮、蟾衣中两类成分的含量差异，为蟾蜍类药材的全面质量控制提供了参考依据。
　　1材料
　　Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪，包括LC-20AT溶液传输单元，SIL-20A自动进样器，SPD-M20A二极管阵列检测器，LC Solution色谱工作站（日本岛津公司），色谱甲醇和乙腈（Fisher公司），其他试剂为分析纯，娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。
　　五羟色胺盐酸盐[阿法埃莎（天津）化学有限公司，纯度为99%]，N-甲基五羟色胺、N，N-二甲基五羟色胺、N，N，N-三甲基五羟色胺、日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵为鲜蟾酥中分离制备，蟾蜍噻咛为干蟾皮中分离得到，面积归一化法测定纯度（N，N-二甲基五羟色胺、蟾蜍噻咛、蟾毒它灵和蟾毒灵均大于98%，N-甲基五羟色胺96.5%，N，N，N-三甲基五羟色胺96.3%，日蟾毒它灵92.9%），华蟾酥毒基（批号110803-200605）和酯蟾毒配基（批号110718-200507）购于中国食品药品检定研究院。
　　蟾酥、蟾皮、蟾衣样品分别收集或采集于山东菏泽、江苏南通等主产区。
　　2方法与结果
　　2.1吲哚生物碱类成分
　　2.1.1色谱条件Nucleosil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，Macherey-Nagel），Brava C18-BDS保护柱（4.6 mm×7.5 mm，5 μm，GRACE），流动相为乙腈-0.5%磷酸二氢钾溶液（6∶94，磷酸调pH 3.2），流速0.8 mL·min^-1，检测波长275 nm，柱温30 ℃。对照品和样品的HPLC图见图1。
　　2.1.2对照品溶液的制备精密称取五羟色胺盐酸盐和N，N-二甲基五羟色胺对照品各适量，甲醇溶解，得质量浓度为0.398 g·L^-1的五羟色胺盐酸盐和0.595 g·L^-1的N，N-二甲基五羟色胺对照品溶液；精密称取蟾蜍噻咛对照品适量，50%乙醇溶解，得0.168 g·L^-1的蟾蜍噻咛对照品溶液；依次精密量取上述3种对照品溶液适量，混合、稀释定容，得质量浓度分别为79.6，67.2，74.4 mg·L^-1的五羟色胺盐酸盐、蟾蜍噻咛和N，N-二甲基五羟色胺混合对照品溶液，上述混合对照品溶液再次稀释得质量浓度分别为39.8，33.6，37.2 mg·L^-1的混合对照品溶液，4 ℃冰箱保存备用。
　　分别精密称取N-甲基五羟色胺和N，N，N-三甲基五羟色胺适量，甲醇溶解，得质量浓度分别为0.778，0.410 g·L^-1的2种对照品溶液；依次精密量取上述2种对照品溶液适量，混合、稀释定容，得质量浓度分别为194，205 mg·L^-1的N-甲基五羟色胺、N，N，N-三甲基五羟色胺混合对照品溶液；上述混合对照品溶液依次稀释得到一系列质量浓度的混合对照品溶液，分别为N-甲基五羟色胺97.3，77.8，48.6，38.9，24.3，19.5，9.72 mg·L^-1，N，N，N-三甲基五羟色胺103，82.0，51.5，41.0，25.7，20.5，10.3 mg·L^-1，4 ℃冰箱保存备用。
　　2.1.3线性关系精密吸取五羟色胺盐酸盐、蟾蜍噻咛和N，N-二甲基五羟色胺混合对照品溶液2，4，6，8，10，15，20 μL进样分析，以进样质量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归处理，得五羟色胺、N，N-二甲基五羟色胺和蟾蜍噻咛的回归方程及线性范围。精密吸取N-甲基五羟色胺、N，N，N-三甲基五羟色胺系列混合对照品溶液各10 μL，进样分析，以质量浓度（g·L^-1）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归处理，得N-甲基五羟色胺和N，N，N-三甲基五羟色胺的回归方程及线性范围，见表1。

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