三生烟叶片与烟花的原生质体制备研究?

　　摘要[目的]探讨三生烟叶片及烟花的高质量原生质体制备方法。[方法]通过优化纤维素酶和离析酶浓度配比、酶解时间、渗透调节剂甘露醇浓度等参数，研究三生烟叶片与烟花原生质体的最优制备方法。[结果]三生烟烟叶材料最佳制备条件为1%纤维素酶和0.5%离析酶、甘露醇浓度0.6 mol/L、酶解时间4 h，完整率达88.22%。烟花材料最佳制备条件为0.8%纤维素酶和0.4%离析酶、甘露醇浓度0.7 mol/L、酶解时间2 h，完整率达83.59%。 [结论]三生烟叶片与烟花原生质体由于材料来源不同，酶解条件存在差异，制备时需要针对不同组织材料予以优化。
　　关键词 烟叶；烟花；原生质体；分离纯化；完整率
　　中图分类号S572文献标识码 A文章编号0517-6611（2016）14-011-04
　　植物原生质体是由脱去细胞壁，仅由质膜包围的，具有生活力的裸露细胞。植物原生质体应用领域广泛，涉及基因表达调控与定位、与宿主蛋白质相互作用、细胞融合[1-5]，以及克服有性杂交不亲和性、花期不育[6-8]等领域的研究。原生质体可在细胞水平上进行基因重组，特别是细胞器，内含基因控制的农艺性状改良，如线粒体所控制的细胞质雄性不育等性状。目标蛋白质的亚细胞定位是通过目标基因载体和荧光表达载体共转化，在特定种类的原生质体中得以表达[9]。在信号通路研究中，原生质体表面膜系统的信号受体蛋白是信号受体研究材料[10]，可有效避免细胞性状差异导致的研究障碍。原生质体由于纯度高、细胞状态相近，在蛋白质组学研究中可极大程度地解决细胞蛋白质响应差异问题，提高低丰度蛋白质的提取纯化效率等问题。
　　烟草研究中通常以烟叶为材料，极少涉及其他组织。以烟叶为材料制备原生质体对烟草生长期要求严格，取材后严重影响烟草幼苗的生长，而烟花具备花期长、生物产量相对较高、生育进程容易控制、生理状态差异小等优点。同时，三生烟也是研究烟草花叶病毒病的重要材料[11]，可以在细胞水平研究其抗性机理，因此，高质量的原生质体是多领域深入研究的基础。鉴于此，笔者研究了三生烟叶片及烟花的高质量原生质体制备方法，旨在为烟草病理研究提供技术手段。
　　1材料与方法
　　1.1材料
　　1.1.1供试品种。烟草品种三生烟（Nicotiana tabacum L.， cv.Samsun NN）种子由中国农业科学院烟草研究所提供。原生质体的提取是以三生烟的四叶期叶片和盛花期烟花为试验材料。
　　1.1.2试剂。纤维素酶（Cellulase R-10）、离析酶（Macerozyme R-10）均为日本Yakult原装进口，甘露醇、MES（ 2-N-吗啉乙烷磺酸）、台盼蓝。
　　1.2方法
　　1.2.1材料的培养。
　　将三生烟种子在75%乙醇中浸泡30 s，在 10%双氧水中消毒 10 min，用无菌水冲洗2～3次。搓揉去除种子的表面蜡质成分，培养皿中25 ℃催芽2～3 d，移植至9孔板培养容器的培养基质中，每个小孔放置2～3颗已发芽种子，十字期移栽进入花盆。培养箱中昼夜温度分别为28和20 ℃，培养至四叶期，取用幼嫩叶片制备原生质体，进入花期后以烟花为材料制备原生质体。
　　1.2.2原生质体的分离。
　　烟叶取材四叶期叶片，烟花为盛开期[12]（开花3 d，花冠开裂成平面）烟花。在超净工作台上将取植物材料剪碎为1 mm×1 mm碎片，置于10 mL 酶解液中，酶解液为CPW盐溶液 （KH2PO4 27.200 mg/L、KNO3 101.000 mg/L、CaCl2·2H2O 1 480.000 mg/L、MgSO4·7H2O 246.000 mg/L、KI 0.160 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L），包含Cellulase R-10、Macerozyme R-10、渗透调节剂甘露醇0.6 mol/L、质膜稳定剂MES 浓度为5 mmol/L[13]，pH 5.8。材料碎片与酶解液充分接触混匀，真空泵抽气30 min，封口后置于26 ℃气浴恒温振荡器内40 r/min回旋振荡，避光酶解。
　　1.2.3酶浓度及酶解时间的优化。
　　前期研究显示纤维素酶和离析酶的最适质量比为2∶1[14]，由于幼嫩叶片和烟花的纤维素含量较低，所以设置叶片的酶浓度梯度为1.50%/0.75%、1.00%/0.50%、0.50%/0.25%，烟花的酶浓度梯度分别为1.60%/0.80%、1.20%/0.60%、0.80%/0.40%，酶解体系均为10 mL。
　　电子显微镜下观察原生质体酶解情况。酶解烟叶每2 h观察一次酶解效果，设置时间2、4、6和8 h；酶解烟花每1 h观察一次酶解效果，设置时间1、2、3和4 h。
　　1.2.4渗透压稳定剂甘露醇的浓度优化。
　　2种材料在最佳酶浓度及酶解基础上，设置甘露醇浓度梯度为0.5、0.6、0.7和0.8 mol/L。原生质体洗涤液中使用含有同浓度的甘露醇洗涤溶液，纯化后观察记录原生质体的产率和完整率。
　　1.2.5原生质体的纯化。
　　2种原生质体均用 300 目不锈钢细胞筛过滤，滤液经 700 r/min离心 5 min，去掉上清液，加 CPW洗涤液5 mL，700 r/min离心 5 min，洗去酶液，弃上清液，预留2 mL 原生质体悬液缓慢覆盖在 5 mL 20%蔗糖溶液上表面，500 r/min离心 5 min，吸取中间层原生质体转入干净离心管，用洗涤缓冲液轻轻洗涤2次，用刻度离心管稀释到1 mL。
　　用血球计数板统计纯化后细胞膜完整的原生质体数量，计算同一计数板上、下2个计数室所测定的原生质体平均值。
　　利用台盼蓝染色可将死细胞染成蓝色，而活细胞拒染的性质，用0.4%台盼蓝对原生质体进行活体染色。原生质体完整率=未染成蓝色的完整原生质体数/原生质体总数 ×100%。3 次重复取平均值，每次重复统计5个视野。

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