基于入血成分的金铁锁药材质量标准研究

　　[摘要] 采用高效液相色谱法建立了金铁锁药材中尿囊素的含量测定方法。金铁锁药材经乙醇提取后，取续滤液进行分析。采用ZORBAX NH₂色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm），检测波长220 nm，柱温40 ℃，流动相为乙腈-水（93∶7），流速1.0 mL·min^-1。结果表明，尿囊素线性关系良好，具有较好的精密度和重复性。在0.010 4 ～ 0.166 g·L^-1，尿囊素的线性相关系数R²=0.999 4（n=5）；RSD（n=6）小于2.1%；平均回收率为95.47%～ 100.9%。该方法具有良好的灵敏度、回收率和重复性，可为金铁锁药材的质量控制提供参考。
　　[关键词] 金铁锁；入血活性成分；尿囊素；高效液相色谱
　　中药是一个复杂的化学体系，它对人体的作用通常也被认为是多成分和多靶点综合效应的结果，因此中药材的质量标准的制定与西药有着跟本的区别。目前，从化学物质基础的角度来制定中药材的质量标准方法主要有色谱法、光谱法以及质谱法等。然而不管选取哪种方法作为中药材的质量控制方法，都必须先选择好合适的对照品。通常对照品的选择大部分都是药材中含量相对较大的特征化合物或者是有效成分。前者虽然是中药材中所含有的主要化合物，但是并不一定是中药材发挥药效作用的化合物，因此选择这样的化合物作为指标性化合物制定的中药材质量标准不能从根本上控制中药材的质量。后者是中药材中具有一定生物活性的化合物，用它来制定中药村的质量标准有一定的理论意义和实践意义。传统中药多为口服给药，其有效物质必须以血液为介质输送到靶点，从而产生作用，因而给药后的血清才是真正起作用的“制剂”，血清中含有的成分才是中药的体内直接作用物质，入血后的活性成分才是真正的有效成分^[1-2]。
　　金铁锁Psammosilene tunicoides为石竹科金铁锁属植物的干燥根，主要分布在贵州、云南、四川、西藏等中国西南地区，是我国西南地区特有的单属种植物，也是贵州民间常用药物，现已作为稀有濒危物种列于《中国植物红皮书》中，属国家二级保护植物。金铁锁以根入药，具有散瘀定痛、止血、消痈排脓之功，用于跌打损伤、风湿痛、胃气痛、创伤出血等的治疗^[3-5]。
　　金铁锁被收录于《中国药典》2010年版中，但在该标准中没有用其化学成分为指标的质量标准项。本研究以金铁锁中的入血化学成分（尿囊素）为指标，建立了金铁锁药材中尿囊素HPLC含量测定方法，该方法的精密度高，重复性好，稳定性好，回收率高，测定结果准确，可为控制金铁锁药材的质量提供科学依据，同时为以化学成分为指标的中药材质量标准的制定提供参考。
　　1 材料
　　高效液相色谱仪Ultimate300高效液相色谱仪（包括四元泵，在线脱气机，自动进样器，二极管阵列检测器，柱温箱），1/10万电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），KQ5200E型超声波清洗（昆明市超声仪器有限公司）。
　　色谱乙腈；水（重蒸水，临用前制备）；无水乙醇；尿囊素对照品（中国食品药品检定研究院，1501-200001）；金铁锁药材经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为金铁锁P. tunicoides（6个不同产地）。
　　2 方法与结果
　　2.1 样品前处理
　　2.1.1 血浆样品前处理 取干燥、粉碎后的金铁锁药材2.0 g，用30 mL 20%乙醇进行超声提取2次，合并提取液，减压浓缩回收溶剂后得金铁锁提取物。取适量金铁锁提取物用水溶解，配成浓度为20 g·L^-1的溶液，通过灌胃给药方式给大鼠（210 g）金铁锁提取物水溶液3 mL，分别在10，30，60，120 min后对大鼠进行采血，将血液离心后取上层血浆100 μL用乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀后离心，将上层清液于氮吹仪上吹干，取93%乙腈100 μL进行溶解，离心后待测。空白血浆按同样方法处理。
　　2.1.2 药材前处理 取金铁锁药材2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶或三角瓶中，加入20%乙醇30 mL，称定质量，超声提取40 min，补重后取续滤液进行测定。
　　2.2 标准溶液的配制
　　精密称取适量尿囊素对照品1.66 mg，加20%乙醇制成每1 mL含0.166 mg的标准储备液，根据需要用20%乙醇稀释成不同质量浓度的标准工作液，即用即配。
　　2.3 高效液相色谱条件
　　ZORBAX NH₂色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（93∶7）；流速1.0 mL·min^-1；检测波长220 nm；柱温40 ℃；进样量5 μL。
　　2.4 入血实验结果
　　将处理好的血浆样品经高效液相色谱仪测定，通过尿囊素对照品及空白血浆样品的高效液相色谱图的比较，确定尿囊素为金铁锁药材中的1个入血化学成分，其结果见图1。
　　2.5 提取条件的选择
　　分别采用回流和超声2种提取方式进行提取，发现超声提取效果较好。对不同浓度的乙醇以及溶剂用量、提取时间和次数进行了考查，最终确定提取条件为30 mL 20%乙醇超声提取40 min。
　　2.6 检测波长的选择
　　根据文献[6-7]以及多次实验考察，发现检测波长为220 nm时效果较好。
　　2.7 柱温的选择
　　考察了不同柱温对尿囊素分离效果的影响，结果发现，柱温为40 ℃时，峰形较好，分离度较好。
　　2.8 线性关系的考察
　　精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的尿囊素1.66 mg于10 mL量瓶中，加20%乙醇配成0.166 g·L^-1的对照品储备液。分别制备得0.010 4，0.020 8，0.041 5，0.083，0.166 g·L^-1 5个质量浓度的溶液，分别精密吸取该对照品系列溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，并以对照品的峰面积（X）为横坐标，浓度（g·L^-1）Y为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程Y=0.013 7X+0.001 2，R²=0.999 4（n=5），结果表明，尿囊素在0.104～1.66 mg线性关系良好。

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