云南复烤烟叶不同地点醇化过程中可培养真菌种群分析

　　摘要：为较全面的了解云南复烤烟叶在不同地点醇化过程中真菌多样性，挖掘其中的有益微生物，提高烟草醇化品质，以复烤烟叶为试验材料，利用18S rDNA克隆测序技术，系统研究了其醇化过程中可培养真菌的种群结构。结果表明，醇化过程中，复烤烟叶叶面真菌数量除曲靖仓库在6月有所上升外，其余各地均随着醇化的进行而逐渐下降，其中曲靖和楚雄两地非常接近，元江最少；通过形态特征及18S rDNA鉴定，烟叶叶面真菌包括根霉属真菌、青霉属真菌、曲霉属真菌等24个真菌属（种）。不同地点，不同时期烟叶叶面真菌的数量、种类及优势种群不尽相同，而根霉属真菌始终为优势种群。
　　关键词：复烤烟叶；醇化；真菌：18S rDNA
　　烟叶是一种经济价值较高的商品，是卷烟工业的主要原料。由于当年复烤的烟叶存在刺激性大、青杂气重、烟气粗糙、余味涩口、香气不够显露等特点，不适宜直接进行卷烟生产，需经过一段时间的醇化来改善烟叶化学成分协调性及评吸质量，从而达到生产标准。在烟叶醇化过程中，微生物及其产生的酶发挥着极其关键的作用微生物不仅可以通过自身的生命活动作用于烟叶醇化过程，还可通过其代谢产生的生物酶参与烟叶的生理生化反应，促进烟叶中生物大分子的转化。有研究表明，将微生物或酶用于烟叶醇化可缩短醇化时间，提高烟叶品质和改善烟气特性。相反，如果醇化过程中某类微生物过度繁殖，则会影响烟叶醇化品质，后续的卷烟生产及质量控制。因此，研究醇化过程中微生物的变化规律，对调控微生物作用，提高醇化效率，乃至揭示烟叶醇化机理具有重要意义。关于烟叶醇化过程中微生物变化已有不少研究，但关于复烤烟叶不同地点醇化其叶面微生物的变化却鲜有报道。
　　云南是我国烟草原料大省，然而云南立体气候特点明显、不同地区生态条件差异显著，势必影响到微生物群落结构差异，从而对烟叶醇化品质产生重要影响。但目前尚未见关于云南复烤烟叶不同地点醇化过程中叶面可培养真菌群落结构的比较研究。基于此，本研究对置于弥勒、曲靖、元江、楚雄4地的红花大金元复烤烟叶叶面可培养真菌数量、种类及其动态变化规律进行研究，为进一步研究烟叶醇化机理和人工调控烟叶醇化进程提供依据。
　　1材料与方法
　　1.1供试材料
　　本试验所用的烟叶为红云红河集团及红塔集团2014年的红花大金元复烤烟叶，共选取7个样品进行试验，分别为昆明WDB2F及WDC3F、曲靖WDC3F及WBBSF、红河WDC3F及WBBSF、大理VC02S。
　　1.2醇化地点及气候条件
　　所有供试红花大金元（简称红大，HD）复烤烟叶样品均分别入库弥勒、曲靖、元江和楚雄4个仓储地。弥勒烟叶仓库的年平均气温19.8℃、湿度为73.3%，曲靖烟叶仓库的年平均气温19.8℃、湿度为58.2%，元江烟叶仓库的年平均气温24.36℃、湿度为65%，楚雄烟叶仓库的年平均气温20.5℃、湿度为59.6%。
　　1.3取样及真菌分离
　　于2015年4、10月：2016年1、7、9月于每个醇化地同步采集自然醇化了0、6、9、15和17个月的烟草样品，采用无菌袋（1500 g/袋）密封包装，每地7个样，共140个样品，测定烟叶叶面真菌种类及数量。
　　在無菌条件下，从每个烟叶样品中随机选取50个烟叶片段，然后用无菌剪刀剪成1cmx1cm大小组织块，并从中随机取30个组织块贴于PDA平板上（10个组织块/平板，平板直径为90mm），28℃恒温培养箱中黑暗培养2～55 d，隔天观察，发现组织块周围有真菌长出，则将其挑取并转接到新鲜PDA平板上，纯化后接于PDA斜面进行分类、鉴定及保藏。
　　1.4菌株鉴定
　　1.4.1形态学鉴定根据菌落颜色、形态、生长速率、质地和分泌物状态与颜色等，将分离得到的真菌分为不同的形态类群（morphotype）之后，从各类群中随机挑取3-5株接种于PDA平板上，经过一段时间的培养后，通过对孢子形态结构与大小、产孢方式与产孢结构等特征来确定菌株的分类地位。对于不产孢的菌株，则进行促孢培养，产孢后按上述方法进行鉴定。对于利用各种方法促孢后仍然不产孢的类群，则依据菌落质地、颜色、生长速率，菌丝颜色、粗细和结构等特征划分为不同的无孢类群组（mycelia sterile）。
　　1.4.2分子鉴定
　　对于那些不产孢或产孢后仍不能确定其分类地位的菌株，则通过测定其18S rDNA序列，并与Genebank上的序列比对后，再结合其形态特征来确定其分类地位。具体做法为：将供试菌株从斜面转接到PDA平板上进行活化，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）提取菌株基因组DNA。随后利用真菌ITS通用引物ITSl（5"-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3"）进行PCR扩增。扩增产物经纯化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，合格后送硕擎生物科技有限公司进行测序。所得序列与NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的序列进行比对，根据覆盖率和相似度并结合形态学特征确定其分类地位。
　　2结果
　　2.1烟叶叶面可培养真菌数量及其动态变化
　　从弥勒、曲靖、元江、楚雄4个醇化地、5个不同醇化时间点的140个烟叶样品的4200个烟叶片段中，共分离得到1636株真菌，其在醇化过程中各醇化地的分布及变化见图1。由图1可知，烟叶经过一段时间的醇化后，除曲靖和楚雄两地在醇化9个月后烟叶叶面真菌数量非常接近外，各醇化地烟叶叶面真菌数量差异较大，但总体而言，在各个醇化时间点都是元江烟叶叶面的真菌数量低于其他3个醇化地（醇化17个月后略高于弥勒）。且除曲靖醇化烟叶叶面真菌数量在醇化6个月时有所上升外，各醇化地烟叶叶面真菌的数量均随着醇化时间的延长而降低。
　　2.2烟叶叶面可培养真菌种类及其动态变化

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